La mise en place d'organoïdes MPOC pour étudier l'hôte

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7635 (2022) Citer cet article

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La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est caractérisée par une limitation du débit d'air et des exacerbations infectieuses, cependant, les systèmes modèles in vitro pour l'étude de l'interaction hôte-pathogène au niveau individuel font défaut. Ici, nous décrivons la mise en place d'organoïdes nasopharyngés et bronchiques d'individus sains et de MPOC qui récapitulent la maladie au niveau individuel. Contrairement aux organoïdes sains, une hyperplasie des cellules caliciformes et une réduction de la fréquence des battements ciliaires ont été observées dans les organoïdes BPCO, caractéristiques caractéristiques de la maladie. La transcriptomique unicellulaire a révélé des preuves de trajectoires de différenciation cellulaire modifiées dans les organoïdes de la MPOC. L'infection par le SRAS-CoV-2 des organoïdes de la MPOC a révélé une réplication plus productive dans les bronches, le site clé de l'infection dans le COVID-19 sévère. L'exposition virale et bactérienne des organoïdes a induit des réponses pro-inflammatoires plus importantes chez les organoïdes MPOC. En résumé, nous présentons un modèle organoïde qui récapitule le microenvironnement pulmonaire physiologique in vivo au niveau individuel et se prête à l'étude de l'interaction hôte-pathogène et des maladies infectieuses émergentes.

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est une maladie respiratoire inflammatoire chronique à morbidité et mortalité globales élevées1. Elle se caractérise par le développement d'une limitation progressive et irréversible du débit d'air, d'endophénotypes hétérogènes et de trajectoires de maladie différentes entre les patients2,3. Les patients souffrent de symptômes respiratoires persistants et progressifs, d'une altération de la fonction pulmonaire, d'anomalies pulmonaires structurelles et d'exacerbations4. Les patients atteints de BPCO présentent également une prévalence plus élevée de comorbidités en développement telles que les maladies cardiovasculaires associées à de moins bons résultats cliniques et à des risques de mortalité plus élevés5. Comme la complexité et l'hétérogénéité de la MPOC entre les patients individuels sont désormais largement reconnues, la recherche cellulaire reste très difficile en raison du manque de modèles expérimentaux appropriés qui récapitulent la maladie au niveau individuel6,7. Les modèles de petits animaux, y compris les souris, les cobayes et les lapins, ont tous été utilisés pour étudier la MPOC, cependant, ils ne peuvent pas récapituler la génétique et l'épigénétique de la maladie humaine, ont besoin que la MPOC soit induite et une fois établie, elle n'imite pas nécessairement l'ensemble du spectre clinique des endophénotypes observés. chez des patients individuels8,9. Par conséquent, l'établissement de modèles cellulaires de nouvelle génération qui surmontent ces limitations et tiennent compte de la variation individuelle sera essentiel pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les réponses d'infection et de traitement au niveau individuel dans la MPOC, permettant l'application d'une médecine de précision basée sur le banc.

Pour faciliter ces études personnalisées, il est primordial de développer des modèles in vitro facilement accessibles qui reproduisent le microenvironnement des voies respiratoires dans la MPOC au niveau individuel. À ce jour, il reste un manque de modèles expérimentaux appropriés pour l'étude de l'interaction hôte-pathogène dans la MPOC. La dernière décennie a vu des avancées majeures dans la génération d'organoïdes dérivés de cellules souches, qui intègrent plusieurs types de cellules dans une architecture tridimensionnelle10. Les organoïdes représentent un outil de laboratoire pour récapituler les caractéristiques fonctionnelles spécifiques aux tissus de leur organe respectif et faciliter l'étude de l'interaction hôte-pathogène. Des modèles organoïdes pulmonaires humains, reproduisant l'organisation épithéliale de leur région anatomique respective, ont été générés avec succès à partir de tissus nasaux11,12, bronchiques13 et alvéolaires14,15 en utilisant des cellules souches adultes ou pluripotentes comme matières premières16,17,18. Les organoïdes pulmonaires ont été utilisés pour étudier le cancer du poumon13,19 et la fibrose kystique13 et pour évaluer l'infection, y compris le virus respiratoire syncytial (RSV)13, l'entérovirus20, le cryptosporidium21, la grippe22,23 et récemment le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) 24,25,26. Les données cliniques et épidémiologiques indiquent que la MPOC est associée à des résultats graves liés à la COVID-19, notamment un risque plus élevé d'hospitalisation et de décès, bien que les mécanismes moteurs fassent défaut27,28,29,30,31,32,33,34.

Outre l'infection virale, l'infection bactérienne représente une proportion importante des exacerbations de la MPOC, les espèces prédominantes isolées comprenant Streptococcus pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa35.

Ici, nous montrons l'établissement et la caractérisation des organoïdes pulmonaires de la MPOC et les appliquons à l'étude de l'interaction hôte-pathogène, y compris le SRAS-CoV-2 et le Pseudomonas aeruginosa. Nos modèles d'organoïdes MPOC récapitulent le microenvironnement pulmonaire physiologique in vivo et entraînent des réponses inflammatoires élevées aux infections virales et bactériennes.

Les organoïdes nasopharyngés et bronchiques humains primaires (NPO et BO, respectivement) ont été établis par des méthodes précédemment rapportées avec modification (Fig. 1a) 13 . Un organoïde des voies respiratoires bien différencié développe une seule ou parfois plusieurs lumières bordées de massues, de calices et de cellules ciliées. Les cellules basales sont situées à l'extérieur et les cils mobiles facilitant le tourbillonnement du mucus ont été visualisés vers l'intérieur (Fig. 1b, c, Fig. 1 supplémentaire et vidéo supplémentaire 1). La coloration par immunofluorescence d'organoïdes non malades a démontré des marqueurs cellulaires pour la protéine tumorale 63 (TP63) + cellules basales, sécrétoglobine membre de la famille 1 A (SCGB1A1) + cellules club, α-tubuline acétylée (Ac-tubuline) + cellules ciliées et mucine 5AC (MUC5AC) + cellules caliciformes dans les NPO et les BO (Fig. 1b, c, Fig. 1 supplémentaire). Des différences marquées ont été observées entre les NPO et les BO, notamment les BO étaient plus ciliés avec des structures Ac-tubuline + cils étendues et une expression du gène FOXJ1 plus élevée (Fig. 1b, c, Fig. 1 supplémentaire). La PCR quantitative (qPCR) a confirmé que les BO expriment significativement plus de TP63, SCGB1A1 et FOXJ1 par rapport aux NPO, bien qu'une expression similaire de MUC5AC ait été détectée entre les NPO et les BO (Fig. 1d – g).

a Illustration schématique de l'isolement des cellules épithéliales humaines primaires du nasopharynx et des bronches et de la génération d'organoïdes humains. b Coloration par immunofluorescence d'organoïdes nasopharyngés humains (NPO) (voies respiratoires supérieures) pour TP63 (cellules basales : vert), SCGB1A1 (cellules en club : violet), α-tubuline acétylée (Ac-tubuline) (cellules ciliées : vert) et MUC5AC ( cellules caliciformes : violet). Les noyaux et la F-actine sont contre-colorés avec du DAPI (bleu) et de la phalloïdine (rouge/blanc), respectivement. Barre d'échelle = 20 μm. c. Coloration par immunofluorescence des organoïdes bronchiques humains (BO) (voies respiratoires inférieures). Barre d'échelle = 20 μm. Les données en bc sont représentatives d'au moins 5 expériences indépendantes. d–g Analyse qRT-PCR de l'ARN total extrait des NPO et des BO pour (D) TP63 (cellules basales), (E) SCGB1A1 (cellules club), (F) FOXJ1 (cellules ciliées) et (G) MUC5AC (cellules caliciformes) ). n = 7 et n = 3 expériences biologiquement indépendantes pour les NPO et les BO, respectivement, sont illustrées. Les données sont présentées sous forme de médianes ± intervalle interquartile et le test U de Mann-Whitney est effectué. *P < 0,05 [TP63 = 0,0333 ; SCGB1A1 = 0,0238 ; FOXJ1 = 0,0238]. HNPEC : Cellules épithéliales nasopharyngées humaines ; BALF : Liquide de lavage bronchoalvéolaire ; HBEC : Cellules épithéliales bronchiques humaines. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les NPO et BO dérivés de sujets BPCO (stades GOLD B, C et D) contiennent tous les types de cellules observés dans des organoïdes non malades (Fig. 2a, b, Fig. 1 supplémentaire). Une plus grande abondance de cellules caliciformes était caractéristique des organoïdes de la MPOC, y compris une expression significativement élevée du gène MUC5AC dans la MPOC par rapport aux NPO non malades (Fig. 2a – c). Dans les BO BPCO, une diminution des populations de cellules massues et ciliées était évidente, caractéristique de l'état de la maladie (Fig. 1, 2b, c supplémentaires). Lorsque les organoïdes MPOC ont été stratifiés par exacerbations chez leurs donneurs, une augmentation de la fréquence des exacerbations était significativement liée à une expression plus élevée du gène MUC5AC dans leur culture organoïde respective (Fig. 2d). Une relation étroite est observée avec la fonction pulmonaire, où ceux dont la fonction pulmonaire est la plus faible (<30 % FEV1 % prédit) présentent l'expression du gène MUC5AC la plus élevée, illustrée par une relation inverse significative entre l'expression du gène MUC5AC et le FEV1 % prédit (R = - 0,5890 ; p = 0,0008 ; Fig. 2e, f). Il est important de noter que cette association cellulaire avec les corrélats cliniques de la MPOC ne s'étend pas aux autres types de cellules présentes dans le modèle organoïde (Fig. 2 supplémentaire). La MPOC présente une clairance mucociliaire altérée qui prédispose à l'infection, et la présence d'un tel dysfonctionnement a été évaluée dans les BO non malades et MPOC dérivés par imagerie par tomographie par cohérence micro-optique (µOCT). Les BO ont démontré une visualisation claire des cils fonctionnels et la fréquence des battements ciliaires (CBF) était significativement plus faible chez les BO BPCO par rapport aux non malades (Fig. 2g, h et vidéo supplémentaire 2).

a Coloration par immunofluorescence d'organoïdes nasopharyngés humains (NPO) et b Organoïdes bronchiques humains (BO) dérivés d'individus non malades (à gauche) et de patients atteints de MPOC (à droite) pour MUC5AC (violet). Le panneau supérieur illustre l'extérieur organoïde tandis que le panneau inférieur illustre la lumière organoïde. Barre d'échelle = 20 μm. Les données en ab sont représentatives d'au moins 5 expériences indépendantes. c Analyse qRT-PCR de l'ARN total extrait des NPO et des BO dérivés d'individus non malades (ND) et de patients atteints de MPOC pour MUC5AC. La ND et la BPCO des stades GOLD B, C et D sont respectivement désignées par des symboles noirs, bleus, jaunes et verts. n = 7 ; n = 10 ; n = 3 et n = 8 expériences biologiquement indépendantes pour NPO-ND ; NPO-MPOC ; BO-ND et BO-COPD sont illustrés. Les données sont présentées sous forme de médianes ± intervalle interquartile et le test U de Mann-Whitney a été effectué. ***P < 0,001. [NPO-ND vs NPO-COPD = 0,0004] d Expression du gène MUC5AC dans les NPO et les BO dérivés de la ND et de la MPOC, cette dernière stratifiée par fréquence d'exacerbation comme non exacerbateur (NE) ; exacerbateur (E) et exacerbateur fréquent (FE). n = 28 échantillons biologiquement indépendants sont illustrés. Les données sont présentées sous forme de médianes ± intervalle interquartile et le test U de Mann-Whitney est effectué. *P < 0,05 ; ****P < 0,0001. [ND contre NE = 0,0117 ; ND contre E < 0,0001 ; ND contre FE < 0,0001]. e Fonction pulmonaire en tant que volume expiratoire maximal dans le 1er deuxième pour cent prédit (VEM1 % prédit). n = 28 échantillons biologiquement indépendants sont illustrés. Les données sont présentées sous forme de médianes ± intervalle interquartile et le test U de Mann-Whitney a été effectué. ***P < 0,001 ; **** P < 0,0001. [ND contre 50–79 % = 0,0003 ; ND contre 30–49 % < 0,0001 ; ND contre <30 % <0,0001]. f Nuage de points corrélant l'expression du gène MUC5AC dans les organoïdes BPCO selon le % FEV1 prédit. n = 28 échantillons biologiquement indépendants sont illustrés. L'analyse du coefficient de corrélation de Spearman (non paramétrique) a été effectuée. P = 0,0008. g Images représentatives capturées à l'aide de l'imagerie par tomographie par cohérence micro-optique (μOCT) des organoïdes bronchiques ND et MPOC à 0 et 14 s (s). Barre d'échelle = 50 μm. Les données en g sont représentatives de 3 expériences indépendantes. h Quantification de la mesure de la fréquence des battements ciliaires (CBF) en Hertz (Hz) des organoïdes bronchiques dérivés de la ND (n = 3) et de la MPOC (n = 3). 6 à 10 organoïdes sont évalués par donneur dans jusqu'à 10 régions d'activité ciliaire par séquence d'images pour déterminer le CBF. Les données sont présentées sous forme de médianes ± intervalle interquartile et le test U de Mann-Whitney est effectué. ***P < 0,001 [P = 0,0008]. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les transcriptomes unicellulaires démontrent que nos organoïdes pulmonaires in vitro récapitulent fidèlement les principales populations cellulaires trouvées dans les voies respiratoires natives in vivo, y compris les cellules basales cyclables, les cellules basales, les cellules club, les cellules caliciformes et les cellules épithéliales ciliées (Fig. 3a, Figure supplémentaire 3a ) dans les NPO et les BO (Fig. 3c, d supplémentaires). Bien que dans un échantillon de petite taille, ce résultat est conforme à notre analyse d'immunofluorescence et de qPCR, comme illustré (Figs. 1, 2). Les identités cellulaires ont été annotées sur la base des ensembles de gènes de signature des voies respiratoires et des cellules pulmonaires dérivés de Garcia et al. (2019) et Travaglini et al. (2020) en utilisant des gènes marqueurs pour chaque groupe de cellules respectif36,37 (Données supplémentaires 1). Nous avons en outre confirmé les identités cellulaires à l'aide de gènes marqueurs spécifiques, par exemple MKI67 pour les cellules basales en cycle, TP63 et KRT5 pour les cellules basales, SCGB1A1 pour les cellules club, MUC5AC pour les cellules caliciformes et FOXJ1 pour les cellules épithéliales ciliées (Fig. 3b supplémentaire). Un seul groupe mineur comprenant environ 1,4 % du nombre total de cellules a été détecté, ne démontrant que l'expression de KRT5, et nous les avons donc classés de manière conservatrice comme "cellules épithéliales". Par rapport aux organoïdes non malades, les organoïdes BPCO ont démontré moins de cellules basales cycliques (5,4 % contre 16,0 %) et de cellules épithéliales ciliées (3,2 % contre 5,2 %) mais plus de cellules basales (45,7 % contre 35,6 %) et de cellules caliciformes (15,9 % contre 11,5 %). %). Les populations de cellules club étaient comparables (29,4 % contre 29,3 %) (Fig. 3b). L'abondance plus élevée de cellules caliciformes et la proportion plus faible de cellules ciliées indiquent l'hyperplasie des cellules caliciformes et les anomalies ciliaires caractéristiques de la MPOC.

a Les tracés UMAP des données transcriptomiques scRNA-seq mettent en évidence les principaux types de cellules détectés dans les organoïdes pulmonaires des non-malades (ND) (à gauche ; n = 8614 cellules) (regroupement d'une lignée NPO-ND et d'une lignée BO-ND) et de la BPCO (à droite ; n = 11 263 cellules) (regroupement d'une ligne NPO-BPCO et d'une ligne BO-BPCO). b Diagrammes à barres empilées de l'abondance relative des neuf principaux types de cellules dans les organoïdes ND et MPOC. c Analyse pseudo-temporelle des organoïdes ND (en haut) et BPCO (en bas) illustrant la trajectoire variable du cycle des cellules basales dans les lignées de cellules ciliées et caliciformes. d Carte thermique illustrant le modèle d'expression altéré, basé sur des marqueurs spécifiques au type de cellule, dans les organoïdes ND et MPOC. Les cellules sont classées par leur état pathologique respectif : ND ou BPCO, type de cellule, pseudo-temps et illustrées par niveau d'expression par les clés de couleur fournies. e Graphiques à barres illustrant les voies canoniques les plus enrichies de l'analyse des voies d'ingéniosité (IPA) dérivées des gènes exprimés de manière différentielle de la MPOC aux organoïdes ND pour les cellules basales, massues et caliciformes, respectivement. Le score z d'activité prédit de l'IPA est codé par couleur (rouge : activation ; bleu : inhibition ; gris : aucun modèle d'activité disponible).

Ensuite, nous avons évalué les ensembles de données RNAseq en vrac accessibles au public dérivés des petites voies respiratoires dans la MPOC (GSE162154) et comparé le profil d'expression des DEG à ceux observés dans l'analyse pseudobulk de nos données scRNAseq. Le regroupement hiérarchique révèle des groupes distincts d'échantillons sains et MPOC. Les principales voies fonctionnelles détectées dans les organoïdes de la BPCO, notamment le dysfonctionnement mitochondrial, le stress du réticulum endoplasmique, la réorganisation du cil, le remodelage de la matrice extracellulaire et la signalisation des cytokines pro-inflammatoires, étaient communes à la fois à l'analyse pseudobulk et aux ensembles de données publics (Fig. 4b, c supplémentaires). Les cellules basales des organoïdes BPCO présentent un modèle fonctionnel très cohérent non observé dans d'autres types de cellules et présentent une trajectoire de développement altérée du cycle des cellules basales dans les lignées de cellules ciliées et caliciformes (Fig. 3c). Une grande abondance de cellules basales dans les voies respiratoires et dans les organoïdes peut entraîner la sous-représentation d'autres types de cellules dans l'analyse RNAseq en vrac. Cela se reflète dans les similitudes fonctionnelles observées entre les transcriptomes des cellules basales des organoïdes pulmonaires et les ensembles de données en vrac RNAseq COPD accessibles au public (Fig. 4c supplémentaire).

La capture de transcriptomes à une résolution unicellulaire dans les organoïdes de la MPOC permet d'évaluer les changements fonctionnels associés à des types de cellules mineurs, non appréciables par l'ARNseq en vrac. Deux sous-populations chacune de cellules basales, massues et caliciformes ont été identifiées avec une abondance significativement différente entre les organoïdes non malades et BPCO, où les organoïdes BPCO sont surreprésentés par les groupes suivants : Cellules basales 2 (35,3 % contre 4,7 %), Club cellules 2 (15, 6% contre 1, 2%) et cellules caliciformes 2 (10, 4% contre 0, 7%), dont aucune n'est observée dans les organoïdes non malades (Fig. 3b – d). Les groupes Cellules basales 2 et Cellules club 2 représentent également le type de cellule intermédiaire prédominant observé dans la trajectoire de développement altérée des cellules basales dans les organoïdes BPCO (Fig. 3b – d). Les organoïdes BPCO démontrent une transition altérée d'un type de cellule à un autre par rapport aux organoïdes non malades (Fig. 3c, d). Ceci est mis en évidence par une nette perte d'expression des gènes marqueurs dans les cellules basales 2, les cellules Club 2 et les cellules caliciformes 2, toutes surreprésentées dans les organoïdes BPCO et leur expression détectable de gènes marqueurs d'autres types de cellules (Fig. 3b – d, Figures supplémentaires 3d, 4a). Pris ensemble, cela suggère une différenciation ponctuée des cellules des organoïdes de la MPOC, probablement attribuable à la pathogenèse de la MPOC.

Pour interroger davantage les voies fonctionnelles différentes entre les organoïdes non malades et ceux de la MPOC, nous avons évalué les différences fonctionnelles entre les cellules basales, massues et caliciformes de chaque modèle organoïde. Les trois types de cellules dans les organoïdes de la MPOC présentent une perturbation de voies canoniques similaires (Fig. 3e). Dans les cellules basales et club, la voie EIF2 et la phosphorylation oxydative ont été nettement activées tandis que la signalisation de la sirtuine a été légèrement supprimée. Des tendances inverses ont été observées dans les cellules caliciformes. Indépendamment, les analyses d'enrichissement d'ensembles de gènes (GSEA) ont capturé des dérangements similaires, mais ont également découvert l'activation des cellules immunitaires dans les trois types de cellules des voies respiratoires (Fig. 4d supplémentaire).

Nos organoïdes pulmonaires humains dérivés se prêtent à l'étude de l'interaction hôte-pathogène. Pour faciliter ces études d'infection et permettre un accès direct du micro-organisme infectant à la population de cellules luminales, les NPO et les BO ont été réorientés pour obtenir une polarité apicale (Fig. 4a, b). Les organoïdes avec des cils orientés vers l'extérieur ont été différenciés en 72 h dans des cellules en suspension et basales positionnées à l'intérieur de l'organoïde sans lumière visible. Les cils fonctionnellement compétents, maintenant orientés vers l'extérieur, induisent l'auto-rotation de l'ensemble de la structure organoïde (vidéo supplémentaire 3).

un diagramme schématique décrivant le flux de travail méthodologique pour l'infection par le SRAS-CoV-2 des NPO et des BO. b Représentation picturale des organoïdes des voies respiratoires «basal-out» et «apical-out» (en haut) et coloration par immunofluorescence des NPO en polarité «basal-out» et «apical-out» pour TP63 (cellules basales: rouge) et Ac-tubuline (cellules ciliées : vert) (en bas). Barre d'échelle = 20 μm. c Coloration par immunofluorescence des NPO et BO dérivés d'individus non malades pour ACE2 (vert). Barre d'échelle = 20 μm. Les données en bc sont représentatives d'au moins 5 expériences indépendantes. d – e Cinétique de réplication virale à partir de surnageants de culture récoltés à partir de (d) NPO et (e) BO infectés par le SRAS-CoV-2 à 1, 24, 48, 72 et 96 h après l'infection (hpi) par dosage TCID50. n = 4 et n = 3 expériences biologiquement indépendantes pour les NPO et les BO, respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM et une ANOVA unidirectionnelle est effectuée. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 [NPO : 48 hpi : L-WU vs O-614D = 0,0005 ; G-614G contre O-614D = 0,0002 ; 72 hpi : L-WU contre O-614D = 0,0170 ; G-614G contre O-614D = 0,0006 ; 96 hpi : L-WU contre G-614G = 0,0041 ; G-614G contre O-614D = 0,0011 ; BO : 24 hpi : L-WU contre O-614D = 0,0070 ; G-614G contre O-614D = 0,0065 ; 48 hpi : G-614G contre O-614D = 0,0048]. f–g qRT-PCR de l'ARN total extrait de (f) NPO et (g) BO infectés par le SRAS-CoV-2 respectivement à 48 et 72 hpi pour l'interleukine-6 ​​(IL-6), l'interféron-β (IFN-β) , CXC motif chimiokine ligand 10 (CXCL10) et facteur de nécrose tumorale-α (ΤΝF-α). n = 3 expériences biologiquement indépendantes sont illustrées. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM et une ANOVA unidirectionnelle est effectuée. *P < 0,05 ; **P < 0,01. [NPO : IFN-β : MK contre G-614G = 0,0399 ; G-614G contre O-614D = 0,0484 ; CXCL10 : 48 hpi : MK contre L-WU = 0,0156 ; 72hpi : MK contre L-WU = 0,0259 ; MK contre G-614G = 0,0018 ; G-614G contre O-614D = 0,0017 ; L-WU contre O-614D = 0,0236 ; ΤΝF-α : 48 hpi : MK contre G-614G = 0,0254 ; L-WU contre G-614G = 0,0069 ; G-614G contre O-614D = 0,0098 ; 72hpi : MK contre G-614G = 0,0374 ; L-WU contre G-614G = 0,0062] [BO : IL-6 : MK contre G-614G = 0,0054 ; L-WU contre G-614G = 0,0282 ; G-614G contre O-614D = 0,0066 ; IFN-β : MK contre G-614G = 0,0055 ; L-WU contre G-614G = 0,0185 ; G-614G vs O-614D = 0,0092]L-WU : souche Clade L-Wuhan ; G-614G : souche Clade G et O-614D : souche Clade O. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les NPO et les BO d'individus non malades et la MPOC expriment l'ACE2, le TMPRSS2, la furine et la neuropiline-1, qui jouent tous un rôle clé dans l'infection par le SRAS-CoV-2 (Fig. 5a–d supplémentaire). Il convient de noter que l'expression des gènes ACE2, TMPRSS2 et neuropiline-1 était significativement plus élevée dans les voies respiratoires inférieures chez les donneurs non malades, sans différence entre les voies respiratoires supérieures et inférieures dans la MPOC (Fig. 5a – d supplémentaire). L'ACE2 a été détecté dans les NPO et les BO étrangers à leur polarité et sans rapport avec le type ou la distribution cellulaire (Fig. 4c). Notre analyse unicellulaire révèle que l'ACE2 est exprimé dans plusieurs types de cellules et que le TMPRSS2 était omniprésent dans la plupart des types de cellules, en particulier les cellules épithéliales ciliées, tandis que la furine était largement colocalisée avec la neuropiline-1 (Fig. 6 supplémentaire). Fait intéressant, les COPD-NPO présentaient une expression plus élevée d'ACE2 et de TMPRSS2 par rapport aux individus non malades, tandis qu'un schéma contrasté est observé dans les COPD-BO (Figs. 5a, b, 6 supplémentaires).

Des relations significatives sont détectées entre l'augmentation de la fréquence d'exacerbation de la MPOC et une expression génique plus élevée pour les quatre facteurs du SRAS-CoV-2 (Fig. 5e – h supplémentaire). Lorsque la fonction pulmonaire est prise en compte, une expression significativement plus élevée de TMPRSS2, de furine et de neuropiline-1 est observée dans la BPCO avec la fonction pulmonaire la plus faible (<30 % FEV1 % prédit) et seule la furine a démontré une relation inverse significative avec FEV1 % prédit (R = − 0,4880 ; p = 0,0072) (Fig. 5i – p supplémentaire).

Les mutations spontanées du génome du SRAS-CoV-2, acquises en continu tout au long de la pandémie, altèrent l'aptitude virale. Nous avons donc sélectionné trois isolats de patients pour évaluer leur pathogenèse différentielle : une souche Wuhan ancestrale dans le Clade L (L-WU, ID d'accession GISAID : EPI_ISL_407987), une souche de Clade O (O-614D, ID d'accession GISAID : EPI_ISL_574486) et une souche Clade G (G-614G, ID d'accession GISAID : EPI_ISL_574489). Des changements d'acides aminés ont été identifiés dans la protéine de pointe-D614G, ORF1ab, et un codon d'arrêt détecté dans NS6 entre G-614G et L-WU tandis que d'autres mutations dans ORF1ab, S, NS7a et N ont été détectées dans O-614D (Supplémentaire Tableau 1). L'infection par le SRAS-CoV-2 n'a pas induit d'effets cytopathiques chez les NPO au cours de la période d'infection de 96 h (Fig. 7 supplémentaire). L'infectivité virale, évaluée par qPCR mesurée à 48 et 72 h après l'infection (hpi), n'a démontré aucune différence significative entre les trois isolats ou entre les voies respiratoires supérieures et inférieures (Fig. 8a – c supplémentaires). L-WU et G-614G se sont répliqués de manière productive dans les NPO et les BO, tandis que l'O-614D n'a pas réussi à se répliquer malgré une réplication productive démontrable dans les cellules Vero-E6 (Fig. 4d, e, Fig. supplémentaires 8d – f et 10). Dans les NPO, représentatifs des voies respiratoires supérieures et un site important pour la transmissibilité du SRAS-CoV-2, le G-614G s'est répliqué à des titres significativement plus élevés par rapport au L-WU à 96 hpi et étendu à 168 hpi (Fig. 4d, Supplémentaire Fig. 8g ). De plus, les organoïdes infectés par G-614G suscitent des réponses immunitaires pro-inflammatoires accrues à 72 hpi caractérisées par une amélioration de l'interféron-β (IFN-β), du ligand de chimiokine à motif CXC 10 (CXCL10) et de l'expression du gène du facteur de nécrose tumorale-α (ΤΝF-α) dans NPO et interleukine-6 ​​(IL-6) et IFN-β dans les BO, respectivement (Fig. 4f, g). L'infection par le G-614G des NPO et des BO augmente significativement le CXCL10 à 72 hpi (Figs. 8h et 9 supplémentaires).

Les données cliniques et épidémiologiques proposent la BPCO comme un facteur de risque indépendant de COVID-1934 sévère. Nous avons donc ensuite évalué l'infectivité, la réplication virale, les réponses pro-inflammatoires et antivirales dans les organoïdes des voies respiratoires afin d'élucider les corrélats cellulaires de ces résultats cliniques. Les investigations étaient basées sur l'infection par les souches L-WU et G-614G mais pas par O-614D car cette dernière n'a pas réussi à se répliquer et à induire des réponses inflammatoires dans les modèles sains. Des niveaux élevés d'infectiosité du SRAS-CoV-2, comparables à ceux de l'état non malade, ont été détectés dans les organoïdes BPCO des voies respiratoires supérieures et inférieures à 48 et 72 hpi (Fig. 11 supplémentaire). Fait intéressant, la cinétique de réplication virale révèle que L-WU s'est répliqué moins efficacement dans les NPO, mais une réplication améliorée a été observée dans les BO dérivés de patients atteints de MPOC (Fig. 5a, b). Aucune différence pour la variante G-614G n'a été observée entre la MPOC et les NPO non malades, bien qu'une réplication significativement améliorée dans les voies respiratoires inférieures (c'est-à-dire les BO) ait été à nouveau évidente dans la première (Fig. 5c, d). Il convient de noter que des lysats cellulaires (détectant l'expression du gène de la nucléocapside (NS)) et des surnageants de culture (détectant le virus infectieux vivant) ont été utilisés dans les expériences qPCR et TCID50, représentant respectivement les différences observées entre la charge virale mesurée et les titres viraux. Pris ensemble cependant, cela suggère une compétence de réplication globale améliorée du G-614G et, de manière critique, un potentiel de réplication virale significativement accru et robuste dans les bronches BPCO, le site prédominant pour le développement de COVID-1934 sévère (Fig. 5c, d ). L'évaluation qPCR de l'IL-6, de l'IFN-β et du CXCL10 n'a révélé aucune différence entre les NPO et les BO après une infection par L-WU avec et sans BPCO. Cependant, l'infection par G-614G a démontré une réduction significative de l'IL-6 et de l'IFN-β dans les voies respiratoires inférieures de la BPCO avec une tendance à l'inhibition de CXCL10 par rapport aux individus non malades (Fig. 5e – h).

a – d Cinétique de réplication virale des NPO et BO infectés par L-WU et infectés par G-614G à 1, 24, 48, 72 et 96 hpi par test TCID50. n = 3 expériences biologiquement indépendantes pour les infections NPO et BO sont illustrées. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM et un test t non apparié est effectué. *P < 0,05 ; ***P < 0,001. [NPO L-WU : 24 hpi = 0,0494 ; 72 hpi = 0,0004 ; BO L-WU : 24 hpi=0,0110 ; 96 hpi = 0,0152 ; BO G-614G : 24 hpi = 0,0294 ; 96 hpi = 0,0457]. e – h Analyse qRT-PCR de l'ARN total extrait de NPO et de BO infectés par L-WU et infectés par G-614G dérivés d'individus non malades et de patients atteints de MPOC respectivement à 72 hpi pour IL-6, IFN-β et CXCL10. n = 3 expériences biologiquement indépendantes sont illustrées. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM et un test t non apparié est effectué. *P < 0,05. [Figue. 5h : IL-6 = 0,0237 ; IFN-β = ​​0,0248] Les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

L'évolution clinique de la BPCO est ponctuée d'épisodes de détérioration clinique appelés exacerbations. Les infections bactériennes représentent une proportion de ces exacerbations et, ici, nous avons étudié les résultats inflammatoires de Pseudomonas aeruginosa et Streptococcus pneumoniae à l'aide de nos NPO "apical-out" de patients atteints de MPOC (Fig. 6 et Supplémentaire Fig. 11). Les NPO non malades et BPCO étaient comparativement sensibles à l'infection par l'une ou l'autre bactérie, et les NPO BPCO induisaient une plus grande réponse pro-inflammatoire à l'infection bactérienne au niveau de l'ARN et des protéines, démontrant la valeur de notre modèle organoïde de BPCO pour évaluer la réponse de l'hôte à l'infection (Fig. 6b– d et Fig. 11 supplémentaire). Le profilage transcriptomique en vrac des NPO BPCO infectés par P. aeruginosa démontre un mouvement ciliaire significativement altéré et une augmentation des activités de remodelage de la matrice sécrétoire et extracellulaire à l'état non infecté par rapport aux NPO non malades. Comme prévu, l'infection à P. aeruginosa de NPO non malades a déclenché une inflammation aiguë avec une production et une signalisation élevées de cytokines (Fig. 6e, f). Notamment, les réponses inflammatoires et au stress étaient significativement améliorées chez les NPO infectés par la MPOC.

a Diagramme schématique décrivant la méthode d'infection bactérienne des NPO. b Analyse qRT-PCR de l'ARN total extrait de NPO infectés par P. aeruginosa dérivés d'individus non malades et de patients atteints de MPOC à 6 hpi pour le gène 16 S de P. aeruginosa. n = 4 et n = 6 expériences biologiquement indépendantes ont été réalisées pour la ND et la MPOC, respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. c Analyse qRT-PCR des NPO infectés par P. aeruginosa à 6 hpi pour le ligand de chimiokine à motif C–C 2 (CCL2), CCL5, le ligand de chimiokine à motif CXC 10 (CXCL10), le facteur de nécrose tumorale-α (ΤΝF-α), l'interleukine -1β (IL-1β), IL-6 et IL-8. n = 4 pour ND et n = 6 pour BPCO. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM et un test t non apparié est effectué. *P < 0,05 [CCL2 = 0,0188 ; CXCL10 = 0,0239 ; IL-6 = 0,0470]. d CCL2, CCL4, CXCL10, TNF-β, interféron-γ (IFN-γ), IL-6, IL-8, IL-9, oncogène α lié à la croissance (GRO-α) et facteur de stimulation des colonies de granulocytes ( G-CSF) libéré lors d'une infection à P. aeruginosa dans des NPO à 6 hpi par test multiplex Luminex. n = 5 pour ND et n = 6 pour BPCO. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM et un test t non apparié est effectué. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; **** P < 0,0001. [CCL2 : BPCO-MK vs BPCO-PAO1 = 0,0039 ; ND-PAO1 vs COPD-PAO1 = 0,0062, CCL4 : ND-MK vs ND-PAO1 = 0,0190 ; BPCO-MK vs BPCO-PAO1 = 0,0040 ; CXCL10 : ND-PAO1 = 0,0014 ; BPCO-MK vs BPCO-PAO1 = 0,0217 ; TNF-β : ND-MK contre ND-PAO1 = 0,0333 ; BPCO-MK vs BPCO-PAO1 = 0,0096 ; IFN-γ : ND-MK vs ND-PAO = 0,0114 ; ND-PAO1 vs BPCO-PAO1 = 0,0002 ; IL-6 : ND-PAO1 vs COPD-PAO1 = 0,0238 ; BPCO-MK vs BPCO-PAO1 = 0,0055 ; IL-8 : MPOC-MK vs MPOC-PAO1 = 0,0099 ; IL-9 : MPOC-MK vs MPOC-PAO1 < 0,0001 ; GRO-α : ND-MK contre ND-PAO1 = 0,0062 ; BPCO-MK vs BPCO-PAO1 = 0,0018 ; G-CSF : ND-MK vs ND-PAO1 = 0,0004 ; BPCO-MK vs BPCO-PAO1 = 0,0005 ; ND = PAO1 vs BPCO-PAO1 = 0,0067]. e Analyse en composantes principales (ACP) des transcriptomes de la ND et de la MPOC NPO qui ont été traités de manière fictive ou infectés par Pseudomonas aeruginosa pendant 6 h (n = 3 par groupe). f Carte thermique des gènes exprimés de manière différentielle (2561 gènes) entre les NPO infectés et non infectés par P. aeruginosa de la ND et de la MPOC, respectivement. Cinq groupes de gènes majeurs basés sur le profil d'expression ont été identifiés et les fonctions biologiques sont annotées. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ici, nous démontrons l'établissement et la caractérisation des organoïdes de la MPOC, dérivés de cellules souches adultes pour étudier l'interaction hôte-pathogène. Les organoïdes de la MPOC sont des structures sphéroïdes tridimensionnelles multicellulaires, présentant des caractéristiques cellulaires essentielles de la MPOC. Les organoïdes de la MPOC présentent une hyperplasie des cellules caliciformes et une réduction de la fréquence des battements ciliaires, liés à la gravité de la maladie sous-jacente de leurs donneurs respectifs et représentatifs de la pathologie attendue de la maladie. L'analyse unicellulaire des organoïdes de la MPOC a révélé des anomalies développementales et fonctionnelles représentatives de l'état de la maladie. L'infection par le SRAS-CoV-2 des organoïdes de la MPOC révèle une réplication plus productive dans les bronches par rapport aux individus en bonne santé, fournissant une base potentielle pour les observations cliniques de résultats COVID-19 plus faibles dans la MPOC.

Le remodelage des voies respiratoires, en réponse aux lésions chroniques et récurrentes des voies respiratoires et à l'inflammation, est une caractéristique pathologique importante des maladies respiratoires chroniques, y compris la MPOC38,39,40. De plus, une hypersécrétion de mucus et une grande abondance de cellules caliciformes caractérisent les voies respiratoires de la BPCO, favorisant l'obstruction des voies respiratoires, une altération de la clairance mucociliaire et des exacerbations41,42,43,44. Les organoïdes de la MPOC récapitulent ce phénotype d'hyperplasie des cellules caliciformes et présentent une expression du gène MUC5AC plus élevée et une fréquence de battement ciliaire réduite par rapport aux individus en bonne santé. Fait intéressant, l'expression du gène MUC5AC dans les organoïdes est significativement associée à la fonction pulmonaire sous-jacente d'un donneur MPOC, à la gravité de la maladie et à la fréquence des exacerbations, et une relation inverse significative entre l'expression du gène MUC5AC et la fonction pulmonaire était apparente. Cette corrélation négative est conforme à une étude multicentrique récente réalisée sur la cohorte COPD SPIROMICS démontrant une augmentation des concentrations de MUC5AC dans les expectorations dans la MPOC en association avec une fonction pulmonaire plus faible (VEM1 % prédit)45. MUC5AC a donc été proposé comme biomarqueur potentiel pour pronostiquer la BPCO.

Les transcriptomes unicellulaires d'organoïdes BPCO, en l'absence d'exposition à la fumée de cigarette, aux stimuli inflammatoires, aux enzymes protéolytiques ou à la modification génétique, révèlent une grande cohérence avec les modèles BPCO in vitro et in vivo existants aux niveaux phénotypique, transcriptomique et fonctionnel46, 47, quoique dans un petit échantillon. Ces analyses révèlent également en outre l'hyperplasie des cellules caliciformes de la MPOC et illustrent une différenciation cellulaire ponctuée dans la MPOC en raison du développement cellulaire intrinsèquement anormal qui caractérise sa pathogenèse. Notre analyse pseudo-temporelle est cohérente avec les études existantes qui démontrent des défauts dans le développement tissulaire, la régénération et la différenciation épithéliale, y compris les voies de signalisation NOTCH, Wnt/β-caténine et Hedgehog observées dans les voies respiratoires de la BPCO48,49,50. Les voies biologiques associées à la MPOC, y compris le dysfonctionnement mitochondrial et la signalisation des sirtuines, ont été découvertes par notre caractérisation unicellulaire des organoïdes de la MPOC, qui offre l'avantage significatif d'évaluer les populations de cellules mineures non reflétées dans l'ARNseq en vrac51,52,53. La perturbation de la structure et de la fonction mitochondriales dans l'épithélium pulmonaire influence des processus clés allant de la différenciation cellulaire, la mort cellulaire et le remodelage cellulaire aux fonctions de barrière physique et à l'immunité innée, qui sont tous liés à la pathogenèse de la MPOC par l'exposition à la fumée de cigarette54. Une biogenèse mitochondriale dérégulée associée à une production accrue d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) peut provoquer un arrêt irréversible de la croissance cellulaire ou une sénescence, en particulier lorsqu'elle s'accompagne d'un déséquilibre entre la capacité oxydante et antioxydante, comme on le voit dans la MPOC55,56. Conformément à nos découvertes, cela est plus évident dans les cellules du club, des cellules très sensibles aux dommages oxydatifs par rapport aux autres types de cellules épithéliales des voies respiratoires57. De plus, la sirtuine 1 (SIRT1) a été impliquée dans le développement et la progression de la MPOC et dans la susceptibilité aux infections virales58,59. Des niveaux réduits de SIRT1 sont observés dans les poumons BPCO et associés à une inflammation accrue en augmentant l'acétylation de RelA/p65 nucléaire et la libération d'IL-859,60. De manière constante, une activation accrue des gènes associés à la réponse immunitaire est détectable dans les cellules basales, massues et caliciformes des organoïdes de la MPOC. Fait intéressant, des profils cellulaires distincts ont été identifiés dans les BO de la MPOC, mais pas dans les autres organoïdes où les "cellules basales 2", les "cellules de club 2" et les "cellules caliciformes 2" étaient surreprésentées. Il est suggéré que l'épithélium nasal agisse comme un proxy pour la région bronchique dans la détection des gènes associés à la MPOC61,62, cependant, nous démontrons que nos modèles organoïdes dérivés des voies respiratoires supérieures et inférieures affichent des profils d'expression génique associés à la MPOC similaires, mais différents profils cellulaires.

Les preuves actuelles suggèrent que les personnes atteintes de MPOC sont plus à risque de COVID-19 sévère, y compris l'hospitalisation, l'admission aux soins intensifs, le besoin de ventilation mécanique et la mortalité27,28,63,64,65,66. Dans cette étude, nos modèles organoïdes, quel que soit leur contexte clinique, démontrent l'expression des principaux facteurs d'entrée du SRAS-CoV-2 et de leurs protéases endogènes associées, notamment l'ACE2, le TMPRSS2, la furine et la neuropiline-167,68,69,70,71 ,72. L'expression d'ACE2 et de TMPRSS2 était significativement élevée dans les organoïdes MPOC (NPO), résultats conformes aux rapports existants observés dans les voies respiratoires des fumeurs et des patients atteints de MPOC73,74,75,76. En utilisant trois clades SARS-CoV-2 phylogénétiquement distincts identifiés en 2020, à savoir le clade L, le clade O et le clade G, nous illustrons que l'isolat du clade G contenant une mutation de pointe D614G s'est répliqué à des titres viraux plus élevés et a démontré des réponses pro-inflammatoires plus robustes77,78, même à des moments prolongés, par rapport aux souches des clades L et O dépourvues de mutation D614G. Ceci est conforme aux travaux antérieurs sur des modèles de voies respiratoires animales79,80,81,82 et humaines81,83. De manière critique, nous démontrons que les organoïdes MPOC étaient plus vulnérables à l'infection par le SRAS-CoV-2, entraînant une plus grande réplication et une inhibition de l'expression de l'IFN-β, en particulier dans la région bronchique, après une infection par le G-614G. Cette compétence de réplication plus élevée, associée à une réponse immunitaire antivirale altérée après une infection au G-614G, fournit un aperçu mécaniste potentiel pour expliquer en partie les pires résultats cliniques observés chez les patients atteints de MPOC atteints de COVID-19. Curieusement, une réplication virale plus efficace n'a été démontrée que chez les BO dérivés de patients atteints de MPOC, tandis qu'un effet contrasté a été observé chez les NPO par rapport à leurs homologues non malades. Ce résultat intéressant peut éventuellement être contribué par la sur-représentation des populations cellulaires de "Basal cells 2", "Club cells 2" et "Goblet cells 2" dans les BO BPCO couplée à l'inhibition de l'IFN-β. Conformément à nos découvertes, une étude récente a démontré que les cellules épithéliales bronchiques dérivées de patients atteints de MPOC sont plus sensibles à l'infection par le SRAS-CoV-2 en raison de leur enrichissement pour l'expression des co-récepteurs, des déséquilibres de protéase et des réponses inflammatoires plus fortes84.

Les virus restent un déclencheur clé des exacerbations de la MPOC85, et une immunité antivirale déficiente dans la MPOC est associée à un risque accru d'exacerbation induite par le virus86,87. On observe une expression réduite de l'IFN dans les bronches BPCO suite à une infection par le rhinovirus et/ou la grippe, tandis que les poumons réséqués d'une BPCO stable démontrent une altération constitutive de l'IFN-β, de l'IRF-7 et d'autres gènes stimulés par l'interféron (ISG)88,89,90,91 . Les exacerbateurs fréquents de la MPOC, plus marqués chez les personnes atteintes d'une maladie grave, présentent une déplétion supplémentaire des interférons de type I et III et d'autres ISG dans les expectorations, même pendant la stabilité clinique91,92,93. Surtout, ce travail augmente encore ces observations en illustrant que l'altération de la réponse à l'interféron peut être tout aussi pertinente après une infection par le SRAS-CoV-2.

De même, les bactéries jouent un rôle important en tant qu'agents causals dans les exacerbations de MPOC où Streptococcus pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa représentent deux des espèces bactériennes les plus fréquemment isolées94,95,96. Les bactéries sont isolées des crachats de BPCO chez jusqu'à 50 % des personnes atteintes d'une maladie modérée à sévère pendant la stabilité, ce qui augmente jusqu'aux deux tiers des individus lors de l'exacerbation97,98. Les conséquences inflammatoires de la présence de bactéries dans les voies respiratoires de la MPOC, y compris celles associées aux exacerbations aiguës, sont associées à une fonction pulmonaire plus faible et à une hospitalisation prolongée99,100. Les organoïdes de la MPOC (NPO), en particulier ceux dérivés d'exacerbateurs fréquents, révèlent des réponses inflammatoires améliorées à la fois à S. pneumoniae et à P. aeruginosa malgré une admissibilité comparable à l'infection, contribuant à des résultats cliniques plus faibles observés dans ce groupe de patients. L'utilisation d'organoïdes MPOC permet potentiellement de mieux comprendre la réponse inflammatoire, au niveau individuel, à des organismes potentiellement pathogènes et peut être utile pour appliquer des approches de précision à l'évaluation des thérapies anti-inflammatoires ou antimicrobiennes dans la MPOC.

Alors que nous établissons et caractérisons les organoïdes MPOC pour la première fois, notre étude a plusieurs limites. L'échantillonnage nasopharyngé et bronchique à utiliser comme matériau de départ pour générer des modèles organoïdes a été collecté auprès de différents donneurs individuels plutôt que des échantillons appariés d'un individu. Les échantillons humains utilisés pour générer des organoïdes non malades (sains) provenaient de donneurs relativement plus jeunes par rapport aux échantillons de MPOC. Notre analyse de scRNA présentée était basée sur un seul échantillon de chaque groupe respectif, et donc une expérimentation plus poussée est justifiée pour valider ces résultats. Bien que nos organoïdes MPOC soient physiologiquement pertinents et représentatifs de l'épithélium des voies respiratoires humaines, ils manquent de complexité comme les systèmes immunitaire et vasculaire, un défi permanent dans le domaine. Bien qu'il aurait été intéressant d'obtenir des données d'ARNc à partir d'organoïdes infectés par le SRAS-CoV-2, ces expériences ont été exclues pour des raisons de sécurité et de logistique.

En résumé, nous établissons et caractérisons les organoïdes MPOC pour étudier l'interaction hôte-pathogène qui représente structurellement et fonctionnellement l'état pathologique sous-jacent. Ces modèles permettent d'évaluer la réponse à l'infection et/ou au traitement médicamenteux, au niveau individuel, et peuvent constituer un ajout utile dans les futures stratégies de préparation à une pandémie où ils se prêtent au dépistage thérapeutique à haut débit et à l'évaluation basée sur la maladie des agents pathogènes en évolution.

Vingt-huit personnes ont été recrutées pour la culture et la caractérisation des NPO et des BO, y compris des volontaires non BPCO (en bonne santé) (n = 10) et des personnes atteintes de BPCO (n = 18). Des écouvillons nasopharyngés floqués (FNPS) et / ou des échantillons bronchiques, collectés par résection pulmonaire et / ou bronchoscopie à fibre optique comme décrit ci-dessous, ont été obtenus comme matériau de départ pour l'expérimentation.

Des sujets avec une spirométrie normale et sans antécédent de BPCO ou de toute autre maladie respiratoire ont été recrutés. Tous les participants étaient des non-fumeurs à vie (à l'exception d'un seul ex-fumeur) et tous les participants ne prenaient aucun médicament à long terme. Les données démographiques des participants sont résumées dans le tableau supplémentaire 2.

Des patients âgés de ⩾45 ans atteints de BPCO stable fréquentant des cliniques ambulatoires respiratoires dans des centres de référence tertiaires pour un suivi de routine ont été recrutés dans trois hôpitaux de deux pays comme suit : l'hôpital général de Singapour (Singapour), l'hôpital St Vincents (Sydney, Australie) et le John Hunter Hospital (Newcastle, Australie). La MPOC a été définie selon les critères de la Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD)1,101. Les patients ayant des antécédents d'asthme (définis par des symptômes variables et une limitation du débit d'air expiratoire selon les directives de la Global Initiative for Asthma ; www.ginasthma.org) et ceux recevant des stéroïdes oraux à long terme ou tout agent immunosuppresseur ont été exclus. La BPCO stable était définie comme l'absence d'exacerbation quatre semaines avant le recrutement de l'étude. Les non-exacerbateurs (NE) ont été définis par l'absence de toute exacerbation documentée au cours de l'année précédant le recrutement de l'étude, tandis que les exacerbateurs de MPOC (E) et les exacerbateurs fréquents (FE) ont été définis comme ayant respectivement moins ou plus de deux exacerbations dans l'année. précédant le recrutement de l'étude. Une exacerbation de MPOC a été définie comme une détérioration soudaine des symptômes respiratoires (toux, production d'expectorations, essoufflement et/ou respiration sifflante) nécessitant un traitement supplémentaire (stéroïdes et/ou antibiotiques) tel que déterminé par le médecin respiratoire principal du patient1. Pour les exacerbateurs fréquents de la MPOC, des antécédents d'exacerbations récurrentes malgré le traitement de la MPOC selon les directives GOLD ont été documentés1,101. Tous les patients recrutés recevaient un traitement approprié pour la MPOC (y compris des conseils de sevrage tabagique, une évaluation des inhalateurs, des plans d'action pour la MPOC, des inhalateurs comme β-agonistes à longue durée d'action, des antagonistes muscariniques à longue durée d'action, des corticostéroïdes inhalés et/ou des bronchodilatateurs à courte durée d'action en plus de la vaccination comme approprié) sur la base des lignes directrices GOLD1,101. Tous les patients ont subi une spirométrie complète (pour déterminer le volume expiratoire forcé dans le 1er second pour cent prédit (VEM1 % prédit). ; Capacité vitale forcée VEMS ; CVF et rapport VEMS/CVF) conformément aux normes techniques définies par les critères ATS/ERS suivis de prélèvement nasopharyngé et/ou bronchique comme décrit ci-dessous102. Les données cliniques complètes et les données démographiques des participants à l'étude sont détaillées dans le tableau supplémentaire 2.

Cette étude a été approuvée par les Institutional Review Boards (IRB) de tous les hôpitaux et institutions participants et un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants. Les numéros de référence relatifs aux approbations éthiques sur chaque site étaient les suivants : CIRB 2020/2338 (Singapour), IRB-2020-05-004 (Nanyang Technological University, Singapour), X02-0137 (The Sydney South West Area Health Service, Australie) et H-163-1205 (Comité d'éthique Hunter New England LHD, Australie). Pour l'isolement des virus utilisés dans cette étude, des échantillons de patients pour la culture ont été collectés selon les directives fournies par PROTECT (2012/00917) comme décrit précédemment103, une étude prospective multicentrique pour détecter de nouveaux agents pathogènes et caractériser les infections émergentes, approuvée par le National Healthcare Group ( NHG) dans le cadre de la préparation à une pandémie pour les épidémies nationales à Singapour. Les travaux entrepris au laboratoire Duke-NUS Medical School Animal Biological Safety Level 3 (ABSL-3) ont été approuvés par le Duke-NUS ABSL3 Biosafety Committee, l'Université nationale de Singapour et le ministère de la Santé de Singapour (BSL3/2007-03/ DA).

L'échantillonnage nasopharyngé a été effectué conformément aux protocoles établis par du personnel formé à l'aide d'écouvillons nasopharyngés floqués (FNPS) avec le kit standard de transport viral universel BBL. En bref, un FNPS a été inséré dans la narine à une profondeur appropriée et tourné plusieurs fois avant le retrait104. Les échantillons ont été immédiatement transférés sur de la glace au laboratoire pour traitement. Les HNPEC ont été libérés des écouvillons par rinçage avec du milieu de transport au moins 20 fois. Les cellules ont ensuite été étalées sur des plaques à 6 puits pré-enduites de collagène humain IV et cultivées dans un milieu d'expansion B/D (tableau supplémentaire 3) additionné de 5 μM de N-[N-(3,5-difluorophénacétyl)-L-alanyl] -S-phénylglycine t-butyl ester (DAPT) pour croître sous forme de monocouches. Le milieu est renouvelé toutes les 48h jusqu'à confluence.

L'échantillonnage bronchique a été effectué chez les patients subissant une résection pulmonaire, une transplantation et/ou une bronchoscopie à fibre optique selon les indications cliniques et selon les directives standard décrites précédemment105,106. Les tissus pulmonaires obtenus à la thoracotomie ont été disséqués et les voies respiratoires isolées. L'épithélium a ensuite été retiré de la couche stromale par macro-dissection. Dans les échantillons obtenus par bronchoscopie, les HBEC ont été obtenues à l'aide d'une seule brosse de cytologie en nylon gainée appliquée sous vision directe. Environ 4 à 8 brossages ont été prélevés des bronches de la deuxième à la troisième génération et les cellules ont été lavées des brosses avec du DMEM. Les cellules ont ensuite été étalées dans des flacons de culture tissulaire dans un milieu de croissance épithéliale bronchique (BEGM) avec des suppléments de croissance et un milieu rafraîchi toutes les 48 h jusqu'à ce que la confluence soit atteinte.

Une fois que les HNPEC et les HBEC ont atteint la confluence sous forme de monocouches, 2 × 105 cellules ont été ensemencées dans la chambre apicale d'un transwell à 24 puits, pré-revêtu de 30 µg/ml de PureCol. Le transpuits contenant les HNPEC ou les HBEC a d'abord été cultivé en phase submergée et une fois la couche cellulaire entièrement intacte, le milieu dans la chambre apicale a été retiré et les cellules ont ensuite été cultivées à une ALI par la suite. Le milieu a été rafraîchi deux fois par semaine et les cellules se sont différenciées pendant 18 jours à l'aide du milieu ALI-Différentiation (ALI-Diff) (tableau supplémentaire 4), puis différenciées en organoïdes des voies respiratoires.

Les ALI-HNPEC ou les ALI-HBEC différenciées pendant 18 jours ont été détachées des transwells avec TrypLE, remises en suspension dans du matrigel et cultivées dans du milieu Airway Organoid (AO) (tableau supplémentaire 5) additionné de 25 % de milieu conditionné R-spondine-1, 25 ng/ ml de FGF7 et 100 ng/ml de FGF10 pour l'expansion. Les cellules ont été développées et ont formé des structures sphéroïdes dans du matrigel. Au jour 5 de l'expansion, les sphéroïdes ont été passés dans la chambre apicale d'un insert à 12 puits pour différenciation à ALI pendant 4 à 6 semaines supplémentaires. Le milieu a été rafraîchi deux fois par semaine en utilisant du milieu AO avec 5 ng/ml de FGF7 et 20 ng/ml de FGF10 pendant 4 à 6 semaines jusqu'à ce que les organoïdes soient bien différenciés.

Des méthodologies pour la génération d'organoïdes apicaux ont déjà été rapportées par d'autres107,108. En bref, les NPO et les BO ont été collectés à partir d'inserts à 12 puits et lavés avec du DMEM/F12 avancé (ad) avec 100 unités/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine (P/S) deux fois. Les NPO et BO lavés ont été incubés avec 5 mM d'EDTA dans du PBS pendant 1 h à 4 ° C avec rotation pour solubiliser le matrigel restant. Les NPO et les BO ont été centrifugés à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C et le surnageant a été éliminé. Le culot a été remis en suspension dans un milieu additionné de 5 ng/ml de FGF7 et de 20 ng/ml de FGF10 et cultivé en suspension en utilisant des plaques de culture tissulaire à 24 puits à fixation ultra-faible. Les NPO et BO suspendus ont été incubés à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 3 jours avant les études d'infection.

Trois souches de SARS-CoV-2 ont été utilisées dans cette étude, dont (1) une souche ancestrale de Wuhan du clade L, hCoV-19/Singapore/2/2020 (L-WU) (ID d'accession GISAID : EPI_ISL_407987) ; (2) une souche du clade O isolée mi-2020, hCoV-19/Singapore/1003/2020 (O-614D) (ID d'accès GISAID : EPI_ISL_574486) et (3) une variante D614G du clade G, hCoV-19/ Singapour/1005/2020 (G-614G) (ID d'accès GISAID : EPI_ISL_574489). La comparaison de séquence des trois souches est présentée dans le tableau supplémentaire 1. Le virus a été propagé dans des cellules Vero-E6 cultivées avec du DMEM additionné de 5 % de sérum bovin fœtal (FBS) et de 1 % de P/S à 37 °C, 5 % de CO2. Les surnageants de culture cellulaire ont été récoltés, centrifugés et aliquotés une fois l'effet cytopathique (CPE) observé. Les titres viraux ont été déterminés par dilution limitée en utilisant la méthode de Karber109.

Des cellules Vero-E6 ont été infectées pour déterminer la dose infectieuse de la culture tissulaire (TCID50/ml). Des cellules Vero-E6 dans des plaques à 96 puits ont été utilisées pour les essais de titrage. Les échantillons ont été dilués en série dans du DMEM, additionné de 5 % de FBS et de 1 % de pénicilline/streptomycine. Les cellules ont été infectées avec 100 µL d'échantillon dilué en quatre exemplaires. Les cellules ont été incubées à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 4 jours. Après l'incubation, les puits avec CPE ont été enregistrés et le titre du virus acellulaire (TCID50/mL) pour chaque échantillon a été déterminé par dilution limitée en utilisant la méthode de Karber109.

Des cellules Vero-E6 ont été ensemencées sur des plaques de culture tissulaire à 24 puits et infectées par le SRAS-CoV-2 à une multiplicité d'infection (MOI) de 0,01 pour déterminer la cinétique de réplication virale des trois souches. Les surnageants ont été récoltés à 24, 48, 72 et 96 hpi et les titres viraux déterminés.

Les NPO et BO apicaux ont été lavés une fois avec adDMEM / F12 avec 1% de P / S avant l'infection et remis en suspension dans 1 ml de milieu AO. 50 µl d'organoïde ont été prélevés et dissociés avec TrypLE express pour le comptage des cellules et, pour déterminer le nombre total de cellules et le volume de virus à utiliser pour MOI = 0,1. Les NPO et BO à sortie apicale ont été infectés par le SRAS-CoV-2 en suspension sur des plaques à fixation ultra-faible pendant 1 h à 37 °C, 5 % de CO2. Après 1 h d'incubation, les NPO et BO infectés ont été lavés trois fois avec adDMEM/F12 et 1 % de P/S. Les organoïdes ont été réintégrés dans du Matrigel à 75 % et ensemencés à raison de 30 ul par gouttelette d'organoïde sur une plaque de culture à 24 puits. 500 ul de milieu AO ont été ajoutés à chaque puits respectif après la solidification du Matrigel. Les surnageants de culture cellulaire ont ensuite été récoltés à 1, 24, 48, 72 et 96 hpi pour le dosage TCID50 et les dosages Luminex. Les lysats cellulaires ont été collectés dans un tampon RLT avec du β-mercaptoéthanol à 48 et 72 hpi pour des analyses quantitatives de réaction en chaîne par polymérase (qPCR) comme décrit ci-dessous.

La souche PAO1110 de Pseudomonas aeruginosa a été cultivée dans un bouillon de soja trypsique (TSB) sous agitation à 37 ° C pendant une nuit. La souche INS-E611 (sérotype 6B)111 de Streptococcus pneumoniae a été cultivée pendant une nuit dans du Todd Hewitt Broth (THB) à 37 °C et 5 % de CO2. Les cultures bactériennes d'une nuit ont été centrifugées et lavées avec du PBS avant la détermination de la concentration bactérienne par mesure de la DO600nm. Pseudomonas aeruginosa a été dilué à une concentration de 5 × 106 UFC/ml et Streptococcus pneumoniae a été dilué à une concentration de 7,5 × 106 UFC/ml dans un milieu AO sans antibiotique avant l'infection. Après la détermination du nombre de cellules, les NPO apicaux ont été infectés en suspension pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2. Après 1 h d'incubation, les NPO infectés ont été lavés trois fois avec adDMEM/F12 et 1 % de P/S. Les NPO ont ensuite été réintégrés dans du Matrigel à 75 % et ensemencés à raison de 30 ul par gouttelette d'organoïde sur une plaque de culture à 24 puits. 500 µl de milieu AO (sans antibiotique) avec 300 µg/ml de gentamicine ont été ajoutés à chaque puits respectif après la solidification du Matrigel. Les lysats cellulaires ont été collectés dans du tampon RLT avec du β-mercaptoéthanol à 6 hpi pour les analyses qPCR. Les surnageants de culture cellulaire ont été collectés à 6 hpi pour la détection des cytokines sécrétoires et des chimiokines à l'aide des tests Luminex.

Les organoïdes des voies respiratoires (AO) cultivés en matrigel ou en suspension ont été imagés et / ou enregistrés sur vidéo à l'aide d'un microscope inversé Nikon Eclipse Ti-U Nikon à l'intérieur de l'installation ABSL3 sous les grossissements indiqués.

Les organoïdes intacts ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante, puis lavés avec du PBS et perméabilisés avec du Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS pendant 30 minutes. Cela a été suivi d'un blocage avec un tampon de coloration (1% BSA, 0,2% Triton X-100 dans du PBS) pendant 1 h. Les organoïdes ont ensuite été incubés avec des anticorps primaires, notamment anti-ACE2, tubuline anti-acétylée, anti-MUC5AC, anti-TP63 et anti-SCGB1A1 dilués dans un tampon de coloration pendant 3 h à température ambiante, suivis d'un lavage trois fois avec du PBS. Les anticorps secondaires marqués AlexaFluor 488, 594 ou 647, la phalloïdine et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ont été incubés avec des organoïdes pendant 1 h à température ambiante. Les organoïdes ont été montés sur des lames de verre avec le support antifade ProLong ™ Glass et recouverts de lamelles de verre. Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM 800 et traitées à l'aide du logiciel d'analyse ZEN Image (Zeiss). Les informations sur les anticorps utilisés dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 7 et tous les anticorps primaires utilisés dans cette étude ont été vérifiés ((Figures supplémentaires 13, 14).

L'ARN total des NPO et des BO avec ou sans infection respectivement a été extrait à l'aide du kit RNeasy Plus Mini conformément aux instructions du fabricant. La transcription inverse a ensuite été effectuée à l'aide du kit de réactifs PrimeScript RT pour générer de l'ADNc dans les conditions suivantes : 37 °C pendant 15 minutes, 85 °C pendant 5 secondes suivi d'une incubation à 4 °C. L'ADNc a été dilué et amplifié à l'aide du Master Mix vert GoTaq® qPCR SYBR dans les conditions suivantes : 95 °C pendant 2 minutes suivi de 95 °C pendant 3 secondes et 60 °C pendant 30 secondes pour un total de 40 cycles. Le gène SARS-CoV-2 N a été amplifié à l'aide du GoTaq® Probe qPCR Master Mix dans les mêmes conditions. Les séquences d'amorces et de sondes utilisées dans cette étude sont résumées dans le tableau supplémentaire 6. -Les travaux liés au SARS-CoV-2 ont été effectués sur un système de PCR en temps réel QuantStudio 6 Flex (Thermofisher Scientific). Une quantification absolue a été effectuée pour les gènes suivants : TP63, SCGB1A1, FOXJ1, MUC5AC, ACE2, TMPRSS2, Furin, Neuropilin-1 et le gène SARS-CoV-2 N à l'aide de courbes standard générées avec de l'ADN plasmidique. Les quantités relatives d'ARNm de P. aeruginosa 16 S, S. pneumoniae lytA, IL-1β, IL-6, IL-8, IFN-β, TNF-α, CCL2, CCL5 et CXCL10 (normalisé avec la β-actine) ont été déterminées en utilisant la méthode 2−ΔΔCt112.

Les surnageants de culture cellulaire de NPO et de BO infectés par le SRAS-CoV-2 à 48 et 72 hpi et de NPO infectés par P. aeruginosa et S. pneumoniae à 6 hpi ont été soumis à un test multiplexé de cytokines à l'aide d'un panel de dépistage de cytokines humaines Bio-Plex Pro ( Biorad) contenant 48 cytokines humaines selon les instructions du fabricant. Les intensités spectrales ont été quantifiées sur une machine MagPix (Luminex Corporation) et un système Bio-Plex 200 (Bio-Rad) pour le SRAS-CoV-2 et les études d'infection bactérienne, respectivement. Les concentrations de cytokines ont été calculées par interpolation à partir des courbes standard jusqu'à l'ajustement de la courbe 5PL.

La technologie µOCT a été décrite précédemment113,114,115,116. En bref, le système µOCT comprenait une console d'imagerie Spectral-domain OCT (SD-OCT) et une sonde de paillasse. Une source de lumière supercontinuum a éclairé un séparateur de faisceau 50/50. La moitié de la lumière source a été transmise à la sonde de paillasse et la lumière renvoyée par la sonde a été relayée à un spectromètre. Le spectromètre était composé d'un réseau de transmission holographique de phase de volume de 960 lignes/mm, d'un objectif de caméra multi-éléments et d'une caméra à balayage linéaire. La lumière réfléchie par le bras de référence et celle diffusée par le bras échantillon ont été combinées avec le séparateur de faisceau vers la console. Le balayage transversal (x, y) a été effectué à l'aide d'une paire de scanners galvanomètres pilotés par une carte de sortie analogique. La sortie de la caméra a été transférée sur une carte d'acquisition d'images.

L'imagerie µOCT a été réalisée sur des BO humains avec un incident d'éclairage sur la vue de dessus des organoïdes. L'axe de l'optique d'imagerie est généralement placé à moins de 10° de la normale au plan cellulaire pour minimiser les erreurs dans les mesures géométriques. La fréquence de battement ciliaire (CBF) est déterminée à l'aide d'une série chronologique d'images et évaluée en quantifiant la fréquence de l'amplitude maximale dans les régions d'image présentant un comportement oscillatoire. En moyenne, 6 à 10 organoïdes sont évalués par donneur dans jusqu'à 10 régions d'activité ciliaire par séquence d'images pour déterminer le CBF. Toutes les analyses d'images ont été effectuées à l'aide d'ImageJ et de MATLAB.

Le séquençage de l'ARN unicellulaire a été effectué selon le protocole standard du kit V3.1 de la bibliothèque Chromium Next GEM Single Cell 3 'GEM Library & Gel Bead, conformément aux instructions du fabricant. En bref, les NPO et les BO ont été lavés une fois avec adDMEM/F12 pour éliminer le matrigel, puis incubés avec TrypLE express pendant 10 min. Des suspensions unicellulaires ont ensuite été obtenues en passant à plusieurs reprises à travers les grandes structures non dissociées avec une pointe P1000. Les cellules individuelles ont été centrifugées et remises en suspension dans du milieu AO pour le comptage des cellules afin d'obtenir une densité de 1000 cellules/µl. Les cellules ont été chargées sur la puce G Chromium Next GEM et exécutées sur le contrôleur Chromium. Les bibliothèques de séquençage ont été préparées selon le protocole standard du fabricant. Les bibliothèques d'ADN ont été séquencées en paires et indexées sur une plate-forme Illumina HiSeq2500 v2 (28x91bp) dans l'installation de séquençage située au Singapore Centre for Environmental Life Sciences Engineering (SCELSE), Nanyang Technological University, Singapour.

Les lectures fastq brutes des NPO et des BO de personnes non malades et de BPCO ont été alignées sur le génome de référence GRCh38 humain à l'aide de Cell Ranger 6.0.2. Les matrices de comptage de cellules individuelles ont ensuite été analysées avec Seurat 4.0117. Les cellules avec < 200 gènes détectés et > 20 % de gènes mitochondriaux ont été exclues. Les ensembles de données filtrés ont ensuite été normalisés à l'aide de la fonction SCTransform dans Seurat et intégrés pour produire un tableau de données unifié pour une analyse comparative en aval entre les non-malades (regroupement d'une ligne NPO-ND et d'une ligne BO-ND) et la MPOC (regroupement d'un NPO -ligne BPCO et une ligne BO-BPCO).

Le regroupement des cellules a été effectué avec le paramètre de résolution défini sur 0,3. Une réduction dimensionnelle non linéaire a été utilisée pour construire les parcelles UMAP unifiées et spécifiques à l'état de la maladie, comme illustré. L'analyse de l'expression différentielle a été effectuée sur la base d'un test de somme de rang Wilcoxon non paramétrique avec les fonctions Seurat FindAllMarkers et FindMarkers, respectivement pour identifier les marqueurs génétiques de chaque groupe de cellules et les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) entre les cellules non malades et les cellules MPOC. L'analyse de l'enrichissement fonctionnel a été réalisée à l'aide de l'analyse Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen) et GSEA118. Pour valider nos modèles d'organoïdes MPOC, nous avons comparé les fonctions les plus enrichies, basées sur les DEG, à partir d'ensembles de données RNAseq en vrac publiés accessibles au public de cellules épithéliales des voies respiratoires en culture et/ou de biopsies cliniques de MPOC à ceux de nos ensembles de données scRNA-seq119. Trois ensembles de données pertinents (numéros d'accès : GSE124180, GSE146532 et GSE162154) ont été identifiés et cartographiés avec Rsubread 3.6.2 sur le gène Ensembl ID120, cependant, GSE124180 et GSE146532 ont dû être exclus car leurs ensembles d'échantillons non malades et MPOC ne formaient pas de grappes distinctes. les uns des autres sur la base de l'analyse en composantes principales (ACP). Par conséquent, seul GSE162154 a été utilisé pour notre analyse comparative. Les ensembles de données RNAseq en vrac ont été téléchargés à partir de Gene Expression Omnibus (GEO).

L'annotation du type de cellule a d'abord été analysée à l'aide des bases de données Blueprint, ENCODE et Human Primary Cell Atlas à l'aide de celldex (1.2.0) qui a confirmé que toutes les cellules présentaient un phénotype épithélial121. Pour déterminer le type de cellule de chaque groupe respectif, la GSEA a été utilisée pour effectuer des comparaisons avec les ensembles de gènes de signature des voies respiratoires et des cellules pulmonaires respectivement de Garcia et al. (2019)36 et Travaglini et al. (2020)37 respectivement. L'analyse pseudo-temporelle a été effectuée à l'aide de Monocle3122 et la trajectoire cellulaire déduite avec les cellules basales cyclées spécifiées comme nœud racine (origine de la trajectoire ; pseudotime = 0).

Les NPO non malades et MPOC ont été soit traités de manière fictive, soit infectés par Pseudomonas aeruginosa (PAO1) pendant 6 h. Les organoïdes ont ensuite été lysés avec du tampon Qiagen RLT plus et l'ARN a été isolé à l'aide du kit Qiagen RNeasy Plus Mini. Les bibliothèques d'ARNm brin pour chaque échantillon ont été préparées avec une purification oligo dT à l'aide du kit d'ARNm brin Illumina TruSeq. Les bibliothèques ont été séquencées à 100 paires de bases (PE100) à l'aide du système Illumina HiSeq2500.

Les données brutes de séquençage apparié au format FASTQ (disponibles dans la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) du NCBI : GSE201465 ont été coupées pour la séquence d'adaptateur/séquence de faible qualité à l'aide de trimmomatic-0.39 (paramètre :/trimmomatic-0.39/adapters/TruSeq3-PE- 2.fa:2:30:10:1:TRUE LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:30). La qualité des lectures de séquences après découpage a été vérifiée à l'aide de FastQC v0.11.8. Les lectures de séquences découpées ont ensuite été mappées sur le génome de référence humain GRCh38.p13 (hg38) à l'aide de la fonction d'alignement disponible dans Rsubread v2.6.4, qui a été exécutée dans le logiciel R v4.1.0 (paramètre : Type=rna). L'extraction du nombre de caractéristiques a été effectuée à l'aide de la fonction featureCounts disponible dans Rsubread v2 .6.4, qui a ensuite été exécuté dans le logiciel R v4.1.0 (paramètres : annot.ext=hg38.ensGene.gtf, isGTFAnnotationFile=TRUE, isPairedEnd=TRUE).

L'expression différentielle des gènes a été réalisée à l'aide de DESeq2 (v1.34.0)123. Les gènes ont été considérés comme exprimés de manière différentielle lorsque le log2 Fold Change> ± 1 et la valeur p ajustée étaient <0, 05. Tous les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) entre les NPO non malades et infectés par P. aeruginosa et ceux infectés par la MPOC ont été soumis à un regroupement hiérarchique en fonction de leur tendance à l'expression pour former 5 groupes de gènes majeurs. Les termes d'ontologie génétique enrichis de chaque groupe de gènes ont été analysés à l'aide de ViSEAGO124.

Pour les expériences non liées à une infection décrites dans les Fig. 1–3, n = 7 ; n = 10 ; n = 3 et n = 8 répétitions biologiquement indépendantes ont été utilisées pour NPO-non malade (ND) ; NPO-MPOC ; BO-ND et BO-COPD, respectivement. Pour les études d'infection décrites dans les Fig. 4–6, au moins n = 3 répétitions biologiquement indépendantes ont été réalisées. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism (version 8.3.0). Les données continues ont été testées pour la normalité à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnoff (test KS). Les données sont présentées sous forme de moyenne avec erreur standard pour les données normalement distribuées, et un test t de Student ou une analyse de la variance (ANOVA) est utilisé pour évaluer les différences intergroupes, le cas échéant. Pour les variables non normales, les médianes sont présentées avec l'intervalle interquartile, et le test de rang signé de Wilcoxon (données appariées) et le test U de Mann-Whitney (données non appariées) sont effectués lors de la comparaison de deux groupes et/ou le test de Kruskal-Wallis pour > 2 groupes , respectivement. Des analyses de coefficient de corrélation de Spearman (non paramétriques) ont été effectuées pour évaluer les corrélations entre les niveaux d'expression de gènes spécifiques et le volume expiratoire forcé dans le 1er deuxième pour cent prédit (FEV1 % prédit). Une valeur p <0,05 a été considérée comme significative et le degré de signification illustré comme suit : *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 et ****P < 0,0001.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Séquençage d'ARN unicellulaire : les lectures fastq brutes des NPO et des BO de personnes non malades et de MPOC ont été alignées sur le GRCh38 humain. p13 (hg38) génome de référence. Trois ensembles de données RNAseq en vrac publiés accessibles au public ((numéros d'accès : GSE124180, GSE146532 et GSE162154) de cellules épithéliales des voies respiratoires en culture et/ou de biopsies cliniques de la MPOC ont été utilisés pour la comparaison avec notre ensemble de données scRNA. Les données de séquençage d'ARN à cellule unique 10 x générées dans cette étude a été déposée dans la base de données GEO sous le code d'accession GSE186017.

Séquençage d'ARN en vrac : les lectures FASTQ brutes ont été cartographiées sur le génome de référence humain GRCh38.p13 (hg38). Les données de séquençage d'ARN en vrac générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données GEO sous le code d'accession GSE201465.

Toutes les autres données pertinentes à l'appui des principaux résultats de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires. Les données sources sont fournies dans cet article. Les données sources sont fournies avec ce document.

Les scripts R pour l'analyse d'ARN-seq unicellulaire sont disponibles sur https://github.com/chenghongsheng/SC_RNAseq-airway-organoid et https://doi.org/10.5281/zenodo.7290276.

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Cette recherche a été soutenue par la National Research Foundation Singapore dans le cadre de son fonds de recherche COVID-19 administré par le Conseil national de la recherche médicale du ministère de la Santé de Singapour (MOH-000409) (à SHC) et le Conseil national de la recherche médicale COVID19RF2-0006 (à LF.W et DEA) et par le National Medical Research Council du ministère de la Santé de Singapour dans le cadre de son Clinician Scientist Award (CSA) (MOH-000710) (SHC). LLYC est soutenu par la Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University dans le cadre de la bourse postdoctorale du doyen et de la bourse Wong Peng Onn (002823-00001). Nous remercions M. Ter Soo Kai de la Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University pour son aide avec les cultures de cellules Vero-E6. Nous remercions M. Mervyn Ong de l'hôpital général de Singapour pour son aide dans la coordination de la collecte et du transport des écouvillons nasopharyngés. Nous remercions le Dr Viji Vijayan et M. Benson Ng de l'établissement Duke-NUS Medical School ABSL3 pour la gestion et l'assistance logistiques. Les auteurs tiennent à remercier le TARIPH Center of Respiratory Research Excellence pour son soutien à la collaboration. Les illustrations schématiques des Fig. 1a, 4a, b et 6a ont été créés avec BioRender.com.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Lin-Fa Wang, Sanjay H. Chotirmall.

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Tsin Wen Yeo

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Brian G. Oliver

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Linbo Liu

École des sciences biologiques, Université technologique de Nanyang, Singapour, Singapour

Nguan Bientôt Tan

Singhealth Duke-NUS Global Health Institute, Singapour, Singapour

Lin-Fa Wang

Département de médecine respiratoire et de soins intensifs, Hôpital Tan Tock Seng, Singapour, Singapour

Sanjay H. Chotirmall

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LLYC, LF.W. et SHC a conceptualisé l'étude; LLYC a établi les organoïdes des voies respiratoires humaines, réalisé des expériences d'infection virale et bactérienne, d'imagerie confocale et d'analyse de données ; DEA, AEZK, RF et AMG ont réalisé des expériences d'infection virale et des analyses de données ; LLYC et HSC ont effectué la préparation de la bibliothèque de cellules individuelles ; HSC, FXI et NST ont effectué une analyse transcriptomique d'ARN unicellulaire et en vrac ; SC et LL ont effectué l'imagerie et l'analyse μOCT ; TPY, MSK, KCH L et YTW ont collecté des échantillons cliniques ; BGO et PABW ont fourni les échantillons bronchiques. KN et PSP ont cultivé les cellules épithéliales bronchiques humaines ; YLC a effectué une immunocoloration pour la vérification des anticorps ; LLYC et SHC ont rédigé le manuscrit ; tous les auteurs ont contribué à l'édition du manuscrit.

Correspondance à Louisa LY Chan ou Sanjay H. Chotirmall.

SHC est membre des conseils consultatifs de CSL Behring, Pneumagen Ltd et Boehringer Ingelheim, a reçu des honoraires de conférence d'Astra-Zeneca et siège aux comités de surveillance des données et de la sécurité (DSMB) pour Inovio Pharmaceuticals et l'Université Imam Abdulrahman Bin Faisal, tous en dehors du travail soumis . Tous les autres auteurs n'ont aucun conflit à divulguer.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Chan, LLY, Anderson, DE, Cheng, HS et al. La mise en place d'organoïdes MPOC pour étudier l'interaction hôte-pathogène révèle une meilleure aptitude virale du SRAS-CoV-2 dans les bronches. Nat Commun 13, 7635 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35253-x

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Reçu : 25 octobre 2021

Accepté : 22 novembre 2022

Publié: 10 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-35253-x

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