Nouvelle biosynthèse de NPs MnO à l'aide de Mycoendophyte : stratégies de biotraitement industriel et mise à l'échelle

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2052 (2023) Citer cet article

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Ce rapport fournit la première description de la mycosynthèse de NP MnO en forme de bâtonnet avec une taille moyenne de cristallite d'environ 35 nm, utilisant des métabolites bioactifs extracellulaires de la souche endophyte Trichoderma virens EG92 comme agents de coiffage/réduction et MnCl2·4H2O comme composant parent . Le milieu de son de blé a été choisi pour cultiver la souche endophyte EG92, qui a produit une variété de métabolites bioactifs dans la fraction extracellulaire, ce qui augmente le rendement des NP MnO à 9,53 g/l. L'ensemble des conditions de croissance du milieu et des champignons qui ont influencé la génération de biomasse ont été optimisés au moyen d'approches d'optimisation statistique successives (conceptions Plackett – Burman et Box – Behnken). Les améliorations de la production ont été obtenues à pH 5,5, WBE (35 %) et taille de l'inoculum (10 %), ce qui a augmenté Xmax à douze fois (89,63 g/l) ; ainsi, la Pmax a été multipliée par huit (82,93 g/l). Après 162 h, Xmax (145,63 g/l) et Pmax (99,52 g/l) du côté de µmax et YX/S ont été déterminés respectivement à 0,084 et 7,65. Grâce à la conception expérimentale de Taguchi, la réaction des NP MnO fabriquées par des champignons a été améliorée en ajoutant 0,25 M de MnCl2·4H2O à 100 % d'extrait fongique (agents réducteurs/coiffants) et en ajustant le pH de la réaction ajusté à ~ 5. Cette réaction a été incubée à 60 °C. C pendant 5 h avant d'ajouter 20 % d'extrait fongique (agent stabilisant). De plus, la Pmax a été multipliée par 40 (395,36 g/l) par rapport à la BC. Nos NPs MnO myco-synthétisées présentent des actions antagonistes plus rapides et plus précises contre les bactéries phytopathogènes que les champignons ; ils pourraient être employés comme nano-bio-pesticides alternatifs et promis pour gérer une variété de différents types de maladies pathogènes à l'avenir.

De nos jours, l'application des nanotechnologies augmente de manière exponentielle dans différentes activités thérapeutiques et agricoles, telles que les antibiotiques, les anticancéreux, les agents antimicrobiens et les bio-engrais1. L'un des défis de la nanotechnologie moderne est le développement de protocoles fiables et sûrs pour la synthèse de nanoparticules. Différentes techniques physiques et chimiques ont été utilisées pour synthétiser autant de nanoparticules et de nanostructures. Récemment, ces méthodologies ont été signalées comme des méthodes dangereuses et coûteuses en raison de la dépendance à des substances dangereuses qui pourraient entraîner des risques potentiels pour l'écosystème2. Par conséquent, l'exploration d'approches durables innovantes, rentables, non toxiques et respectueuses de l'environnement devrait être d'un intérêt crucial. Ainsi, la nanotechnologie verte a suggéré de développer des techniques rentables et écologiquement durables pour fabriquer des nanoparticules métalliques.

Il existe de nombreuses nanoparticules de métaux et d'oxydes métalliques telles que les nanoparticules Ag, Au, Fe2O3, CaO, MgO, TiO2, ZnO et CuO que différentes sources biologiques ont biosynthétisées3,4,5,6,7. Les champignons, les bactéries, les plantes et même les algues peuvent être utilisés efficacement comme usine verte pour fabriquer des nanoparticules qui recèlent d'immenses applications potentielles, en particulier dans les secteurs biomédical et agricole8,9,10. Par conséquent, la synthèse verte des nanoparticules peut être contrôlée par les métabolites bioactifs produits tels que les protéines, les acides aminés, les glucides, les alcaloïdes, les phénols et même les enzymes qui sont utilisées comme agents réducteurs et stabilisants. Mais diverses sources biologiques ne pourraient pas être appliquées dans les secteurs agricoles en raison de leurs propriétés pathogènes. Il est donc hautement plausible d'utiliser des molécules bioactives sûres qui pourraient être extraites de cellules biologiques sûres2,11. Il existe plusieurs micro-organismes isolés dans la rhizosphère (microbes du sol) qui ont été largement exposés en tant que synthétiseurs de nanoparticules et peu de rapports sur les endophytes (microbes des tissus végétaux). Il est donc important de se concentrer sur ces voies biologiques prometteuses de nano-usines qui ont produit différentes nanoparticules métalliques avec des tailles et des formes attrayantes pour différentes applications biologiques, y compris des propriétés antimicrobiennes, cytotoxiques et antioxydantes12,13. Les micro-organismes tels que les bactéries, les actinomycètes et les champignons qui vivent dans les tissus ou les cellules végétales sans causer de blessure à leur hôte ont été appelés endophytes. Ils ont considéré des candidats attractifs pour ouvrir une nouvelle gamme de systèmes de biosynthèse professionnels liés à la biologie et aux nanotechnologies. Cette approche est rentable, écologiquement durable et peut fournir des nanoparticules avec une taille et une forme mieux spécifiées sans beaucoup d'ions métalliques14,15. Les endophytes fongiques (mycoendophytes), en particulier Trichoderma spp., produisent une grande variété de nouveaux métabolites bioactifs sûrs (flavonoïdes, alcaloïdes, polysaccharides et enzymes) qui pourraient être utilisés comme source potentielle pour produire des nanoparticules par des méthodes intracellulaires et extracellulaires. Car les molécules bioactives sécrétées intra et extracellulaires jouent le rôle principal dans la biosynthèse des nanoparticules (approche bottom-up) en réduisant les sels métalliques, puis les ions métalliques. La méthode de fabrication écologique des nanoparticules à médiation fongique présente de nombreux avantages, tels que la simplicité avec laquelle le processus de fermentation peut être mis à l'échelle, le traitement en aval, outre la rentabilité d'une chaîne de production de biomasse, et le potentiel de fabrication efficace des nanoparticules. . Par conséquent, une variété de champignons filamenteux ont été efficacement appliqués pour la biosynthèse extracellulaire et intracellulaire de différents métaux et de nanoparticules d'oxydes métalliques3,16.

Plusieurs rapports s'intéressent à la bio-synthèse ou (synthèse verte) des NPs MnO à partir d'extraits végétaux et bactériens ; cependant, aucune étude ne rapporte la biosynthèse des NP MnO à l'aide des métabolites bioactifs extraits de champignons, en particulier de souches mycoendophytes. Ici, l'application de cellules fongiques en tant que candidat producteur vert pour la bio-fabrication de nanoparticules a suscité un intérêt significatif dans la communauté des nanobiotechnologies. De plus, pour la biosynthèse à grande échelle industrielle des nanoparticules, divers paramètres physicochimiques, en plus de toutes les conditions de culture microbienne, ont été optimisés pour produire des NP MnO homogènes, avec une activité antimicrobienne satisfaisante. Ainsi, tous les objectifs ci-dessus ont été étudiés statistiquement avec succès pour obtenir la chaîne de production industrielle des NP MnO en utilisant l'un des endophytes compétents.

Selon les domaines d'application, les nanotechnologies impliquent diverses approches pour les matériaux nanostructurés telles que des techniques physiques, chimiques et biologiques. Depuis, la méthode de fabrication biologique est apparue comme une technique prometteuse et respectueuse de l'environnement pour surmonter les effets secondaires accompagnés de méthodes de fabrication physiques et chimiques8. Ainsi, la nouvelle branche de la nanotechnologie est apparue récemment sous le nom de nano-biotechnologie, où des nanoparticules ont été fabriquées biologiquement en utilisant des métabolites bioactifs extraits d'entités biologiques telles que des plantes, des algues, des bactéries et des champignons1,9,10,17. Cette méthode biologique est considérée comme une technique commercialement viable, propre, écologique et non toxique pour fabriquer certaines nanoparticules appliquées en médecine et en agriculture12,18. Pour la mise à l'échelle des nanoparticules fabriquées, une nouvelle expression apparue dans la nanotechnologie a été appelée "nanotechnologie industrielle". De nos jours, la fabrication à grande échelle de nanoparticules est une condition obligatoire pour développer plusieurs industries sans détruire la santé humaine et l'environnement en utilisant des substances toxiques ou à haute énergie15,19. Ainsi, le nouveau domaine scientifique prometteur est apparu sous le nom de nano-biotechnologie industrielle. Le processus biologique rentable a été appliqué pour réduire les problèmes de risques pour la santé et les inconvénients environnementaux, comme indiqué dans le présent travail.

Ces derniers temps, les cellules fongiques ont été découvertes comme de puissantes bio-usines pour la fabrication de certaines nanoparticules car elles contiennent divers métabolites bioactifs. Étant donné que la plupart des champignons nécessitent un petit nombre de nutriments, sont faciles à manipuler et peuvent être filtrés, les champignons sont préférés aux autres cellules biologiques en raison de l'économie de coûts d'investissement considérables pour la fabrication de nanoparticules3. Le mycoendophyte (endosymbionte) inhibe les tissus végétaux sans détruire les cellules hôtes. Au cours des dernières décennies, ces mycoendophytes ont fait l'objet d'une grande attention en raison de leur production illimitée de métabolites bioactifs, tels que le phénol, les stéroïdes, les flavonoïdes, les peptides, etc.20,21,22. Ces mycoendophytes sont relativement inexplorés en tant que source potentielle de métabolites bioactifs mixtes utilisés pour la biosynthèse des nanoparticules1,8. Alors qu'un agent antimicrobien prometteur pourrait être des métabolites organiques; par exemple, des enzymes ou des composés inorganiques en tant que métaux en fonction de leurs activités antimicrobiennes à large spectre et de leur tolérance aux conditions de traitement industriel à grande échelle5. Récemment, les nanoparticules d'oxyde métallique ont été explorées en tant que classe potentielle d'agents antimicrobiens en raison de leurs applications potentielles dans la sécurité alimentaire en fonction de leur forme, de leur taille, de leur stabilité et de leurs propriétés de surface16,23,24. En particulier, les NP MnO ont des propriétés physiques, chimiques, électriques, magnétiques et catalytiques distinctives importantes, qui ont suscité de nombreux intérêts de recherche. La plupart des rapports scientifiques se sont concentrés sur l'estimation des propriétés chimiques, physiques et catalytiques en plus de l'application des NP MnO en utilisant ses propriétés électroniques et ses activités catalytiques ; cependant, ses activités antimicrobiennes ont rarement été étudiées24. Plusieurs rapports s'intéressent à la biosynthèse ou (synthèse verte) des NPs MnO à partir d'extraits végétaux et bactériens ; cependant, aucune étude ne rapporte la biosynthèse des NP MnO en utilisant les métabolites bioactifs extraits de champignons, en particulier de souches mycoendophytes25. Ainsi, l'exploration des NP MnO myco-synthétisées à l'aide de bio-usines potentielles sûres, bon marché et les plus simples telles que Trichoderma sp., possède de nouvelles activités antimicrobiennes considérées comme une application moderne compétente dans de nombreux domaines, en particulier dans les secteurs agricoles. Ici, différents isolats mycoendophytiques ont été utilisés pour synthétiser les NP MnO, puisque la réaction fabriquée finale a été facilement reconnue via sa couleur passée du jaune au brun rougeâtre. Par la suite, les NP MnO fabriqués ont été testés en tant qu'agent antimicrobien contre les phytopathogènes, puis l'isolat compétent qui a produit les NP MnO les plus efficaces en tant qu'agent antimicrobien a été sélectionné. Étant donné que les activités antibactériennes les plus prometteuses (P ≤ 0,05) ont été enregistrées contre des bactéries phytopathogènes telles que Erwinia amylovora (34,0 ± 2,69 mm) suivie par Acetobacter pasteurianus (30,0 ± 2,45 mm) et Erwinia persicina (28,5 ± 5,4 mm). En outre, les NP MnO mycosynthétisées ont été testées comme agent antifongique, et les activités antifongiques les plus élevées ont été mesurées contre Aspergillus flavus (24,5 ± 3,20 mm) et Aspergillus niger (20,5 ± 2,06 mm), suivis de Fusarium solani (19,25 ± 3,26 mm) comme indiqué dans le tableau 1. En conséquence, l'isolat choisi a été identifié génétiquement à l'aide des données de séquence d'ADNr données à l'aide de l'analyse GenBank Blast. Cet isolat a été soumis dans la base de données GenBank en tant que souche endophyte de Trichoderma virens EG92 avec le numéro d'accession MF429775 car il était complètement similaire à Trichoderma virens, comme le montre la Fig. 1.

Arbre phylogénétique et diversité de la séquence partielle des gènes de l'ARN ribosomique des petites et grandes sous-unités (espaceur interne transcrit 1, gène de l'ARN ribosomal 5,8S et espaceur interne transcrit 2) dans la souche endophyte Trichoderma virens EG92 (MF429775) par rapport aux souches de référence. Cet arbre a été construit à l'aide de l'analyse de la jonction par les voisins et du maximum de vraisemblance (logiciel MEGA10.1.7 2020). La divergence de séquence est indiquée par une barre d'échelle.

Dans cette étude, les NP MnO myco-synthétisées ont été détectées pour la première fois à l'œil nu lorsque la couleur de la réaction est passée du jaune à la suspension brun jaunâtre et brun rougeâtre, comme présenté sur les figures 2B, C; due à l'excitation des vibrations du plasma de surface26. De plus, les pics d'intensité d'absorption UV – Vis augmentent avec une absorbance maximale à 350 nm, ce qui confirme la mycosynthèse des NP MnO, comme le montre la figure 2A. Ainsi, la couleur de la réaction et le spectre UV-Vis indiquent que la mycosynthèse des NP MnO bien réduites/stabilisées a été réalisée avec succès. La spectroscopie UV-Vis est la technique la plus largement utilisée pour examiner les propriétés optiques des nanoparticules produites en détectant le large pic d'absorption18,27. Selon les rapports précédents, les spectres d'absorption UV-Visible des NP MnO variaient de 284 à 400 nm en raison des transitions n → π⃰ et π → π⃰11,24,25. De plus, différents pics d'absorption des NP MnO ont indiqué une différence dans les variations de forme et de taille des nanoparticules fabriquées selon la méthode de synthèse1,10.

(A) Les spectres UV-Vis des NP MnO fabriqués par des champignons ont montré un pic de résonance plasmonique de surface à 350 nm, (B) Les NP MnO fabriqués finaux, (C) L'extrait de la souche endophyte Trichoderma virens EG92, et (D) Image SEM de Les NP MnO fabriquées par des champignons montrent leur structure en forme de bâtonnet.

Auparavant, différentes formes et tailles de nanoparticules synthétisées dépendaient d'agents réducteurs/coiffants6,25. Ainsi, SEM a été utilisé pour analyser les caractères morphologiques de nos NP MnO myco-synthétisés. Le caractère morphologique des NP MnO fabriqués a été détecté par une enquête SEM (Fig. 2D), qui montre l'agglomération survenue au cours de la réaction de biosynthèse. L'image SEM montre une forme très claire de NP MnO à la morphologie en forme de bâtonnet. En outre, sa composition élémentaire a été déterminée par analyse EDX, qui montre un fort et plusieurs signaux de Mn ainsi qu'un signal d'O, qui pourraient provenir des métabolites bioactifs (matériaux organiques coiffants) (Fig. 3A). De plus, le profil EDX montre les NPs myco-synthétisées-MnO comme une teneur de haute pureté composée de Mn (64,45%) et O (35,5%).

Caractérisation des NP MnO fabriquées par des champignons à l'aide d'un extrait endophyte de la souche EG92 de Trichoderma virens via l'analyse EDX (A), le profil thermique TGA (B) et l'analyse XRD (C).

La figure 3B montre le thermo-profil TGA des NP MnO myco-synthétisés, qui ont été testés à différentes températures jusqu'à 800 ° C. La pente résultante de la courbe TGA montre une petite perte de poids d'environ 5, 5% observée à 815 ° C, qui pourrait être due à la libération d'eau, de métabolites bioactifs n'ayant pas réagi et enrobés qui entouraient la surface des NP MnO myco-synthétisés. En outre, le schéma XRD des NP MnO myco-synthétisés à l'aide de la souche endophyte Trichoderma virens EG92 est complètement fermé au schéma standard de l'α-MnO tétragonal centré sur le corps (fichier JCPDS n° 44-0141), qui a confirmé que la production de NP MnO est accompli avec succès (Fig. 3C). Les pics de diffraction nets ont été détectés à 2θ de 18, 56 °, 28, 90 °, 37, 34 ° et 63, 74 °, indexés dans les facettes (200), (310), (211) et (512), respectivement. Via les modèles XRD, la taille moyenne des cristallites pour les NP MnO myco-synthétisées est calculée à l'aide de la formule de Scherrer à 35 nm.

Tous les endophytes ont produit différents métabolites secondaires (flavonoïdes, terpénoïdes, sucres, cétones, aldéhydes, acides carboxyliques, etc.) pour protéger leurs hôtes contre les prédateurs et les conditions de stress25,28. Ces métabolites bioactifs pourraient être responsables de la réduction des nanoparticules18,29. Ainsi, les composés phytochimiques extraits de la souche endophyte testée de Trichoderma virens EG92 ont été analysés. La spectroscopie FTIR a été utilisée pour identifier les métabolites bioactifs dans l'extrait fongique qui participent en tant qu'agents réducteurs-coiffants et stabilisants dans la réaction de fabrication des NP MnO ; comme le montre la figure 4A. Depuis la possibilité de biomolécules responsables du coiffage/stabilisation des NPs MnO myco-synthétisées ; particulièrement faible teneur en matières inorganiques et organiques qui sont détectées par analyse FTIR. Les pics d'absorption prononcés ont été observés à ν 3921 cm−1 (vibration d'étirement O–H), ν 2117 cm−1 (vibration d'étirement C–C), ν 1639 cm−1 (C = vibration d'étirement), ν 1107 cm−1 (vibration de déformation CH3), ν 1064 cm−1 (groupe amine), ν 962 cm−1 (un groupe aromatique), ν 759 cm−1 (vibration de déformation CH2), ν 644 cm−1 (groupe –OH), et ν 437 cm−1 (vibration du squelette C–C). Ceux-ci indiquent que différents groupes fonctionnels pourraient être impliqués dans les NP MnO myco-synthétisés.

Spectres FTIR de l'extrait de la souche endophyte Trichoderma virens EG92 (A) et des NP MnO fabriquées par des champignons (B).

Sur la figure 4B, différentes bandes FTIR ont disparu dans des spectres biosynthétisés, tels que ν 1325, 1209 et 1107 cm−1 attribués aux vibrations des groupes O–H, O–H–O et CH3. De plus, la bande est apparue à ν 1410 cm−1, ce qui indique la présence d'une vibration de déformation C–H. Ainsi, ces changements dans le spectre FTIR pourraient être reconnus comme les groupes actifs utilisés pour compléter la biosynthèse des NP MnO. Tandis que les vibrations de flexion méta-oxygène Mn – O – Mn des NP MnO myco-synthétisées ont également été identifiées dans des bandes inférieures à ν 750 cm−1, enregistrées à ν 615 et 516 cm−1. La présence de phénols, d'alcaloïdes, de glucides, d'acides aminés et de biomolécules protéiques dans l'extrait fongique et les NP MnO mycosynthétisés pourrait aider à convertir les ions Mn en NP MnO et les enrober d'un bouclier de diverses biomolécules, selon les pics observés et résultats d'analyses phytochimiques.

Les cellules fongiques produisent normalement des métabolites importants qui convertissent les matières toxiques en matières non toxiques. Ces métabolites pourraient être responsables de la bio-fabrication de nanoparticules puisque certaines molécules bioactives jouent un rôle clé dans cette méthode30,31,32. Généralement, les cellules fongiques étaient utilisées pour synthétiser des nanoparticules de manière extracellulaire et intracellulaire, en particulier des champignons endophytes qui sécrétaient de nombreux métabolites bioactifs tels que des protéines et des polypeptides phytochimiques, et des enzymes en dehors des hyphes et d'autres étaient piégées dans les cellules33. Par rapport aux autres microbes, les champignons endophytes ont une plus grande tolérance et capacité de liaison aux sels métalliques; par conséquent, ces cellules fongiques présentent un avantage pour la production à grande échelle de nanoparticules, y compris des processus en aval efficaces et peu coûteux. En outre, d'autres rapports ont révélé que les champignons endophytes ont une cinétique plus lente, de sorte que la forme et la taille des nanoparticules produites ont une stabilité à long terme, en particulier produites de manière extracellulaire31. Ici, la réaction de biosynthèse des NP MnO via la souche endophyte Trichoderma virens EG92 dépendait de ses métabolites bioactifs produits utilisés comme agents réducteurs/coiffants et stabilisants. La culture de la souche endophyte de Trichoderma virens EG92 a été étudiée en utilisant différents milieux fongiques industriels pour maximiser sa production de métabolites bioactifs, comme le montre la Fig. 5.

Différents milieux sélectionnés pour la culture de la souche endophyte Trichoderma virens EG92 pour fabriquer des NP MnO. Milieu Czapek-Dox (CDM), milieu de malt de levure (YMM), milieu synthétique (SM), milieu de tourteau de soja glucose (GSM), milieu de glucose de levure (YGM) et milieu de son de blé (WBM).

La souche endophyte Trichoderma virens EG92 a été bien cultivée en utilisant tous les milieux testés (CDM, YMM, SM, GSM, YGM et WBM). Cependant, le milieu compétent était le WBM, qui a produit le poids de masse cellulaire le plus élevé (6, 91 g / l) et le rendement en NP MnO (9, 53 g / l), sélectionné pour des études ultérieures. Par la suite, les métabolites bioactifs produits ont été distingués en fractions fongiques cytoplasmiques et extracellulaires pour détecter le compartiment cellulaire compétent utilisé pour maximiser le poids massique des NP MnO (tableau 2).

La souche endophyte cultivée EG92 à l'aide de WBM a produit des alcaloïdes et des phénols, ainsi que de faibles quantités de glucides totaux (14,69 mg/µl) et de protéines totales (12,65 mg/µl) dans une fraction cytoplasmique utilisée pour fabriquer des NP MnO (2,03 g/l) . Alors que la fraction extracellulaire testée contient différents métabolites bioactifs tels que des alcaloïdes, des tanins, des phénols, des stéroïdes et des terpénoïdes, ainsi que des quantités de glucides totaux (21,65 μg/ml) et de protéines totales (16,3 mg/µl) qui ont produit 9,53 g/l des NP MnO. Enfin, WBM a été choisi pour cultiver la souche endophyte EG92 qui a produit différents métabolites bioactifs dans des fractions extracellulaires, maximisant le rendement des NP MnO à 9,53 g/l. La culture de souches de Trichoderma à l'aide d'extrait de son de blé a été fortement soutenue par des rapports antérieurs34,35. Étant donné que la matière organique extraite des déchets agricoles était généralement utilisée comme source de nutriments riche, non dangereuse et rentable pour cultiver des cellules microbiennes, en particulier des cellules fongiques. Les extraits de son de blé ont montré beaucoup de protéines, d'acides aminés, d'éléments et de glucides disponibles, de sorte qu'il a déjà été signalé comme un milieu de croissance qualifié pour la culture à faible coût de Trichoderma spp. utilisant la fermentation à l'état solide; cependant, il n'a été utilisé que rarement dans un système de fermentation immergé36.

Jusqu'à présent, plusieurs approches ont été appliquées pour les stratégies d'optimisation, telles qu'une variable à la fois (OVAT) et les plans d'expériences statistiques (DOE)19,25,37. La stratégie OVAT est considérée comme une méthode non efficace et chronophage car toutes les variables ont été étudiées séparément en ignorant les interactions entre ces variables. Cependant, les approches DOE pourraient surmonter ces problèmes et réduire le nombre d'essais et l'erreur expérimentale. La plupart des chercheurs ont largement utilisé les plans de Plackett-Burman, puis de Box-Behnken pour optimiser les variables testées. Dans nos tentatives, la méthode OVAT a été utilisée pour réduire la plage de fonctionnement pour toutes les variables testiculaires, puis a appliqué le DOE. Comme le montre la figure 6, les facteurs qui ont affecté les quantités de nutriments solubles extraits à l'aide de poudre de son de blé ont été étudiés afin de maximiser la biomasse des rendements de la souche endophyte EG92 et des NP MnO. Étant donné que le poids optimisé du son de blé était de 50 g/l, cela affectait le poids de la masse de cellules fongiques produites (10,06 g/l) et les NP MnO (13,4 g/l), comme le montre la figure 6A.

Conditions efficaces d'extraction des nutriments solubles de la poudre de son de blé qui ont affecté la production de biomasse de la souche endophyte Trichoderma virens EG92, puis la fabrication de NP MnO.

De plus, le poids maximal de la masse cellulaire fongique (10, 5 g / l) et les NP MnO (14, 3 g / l) ont été enregistrés après 24 h de processus d'extraction (Fig. 6B). Dans le même temps, le pH de la solution d'extraction a été ajusté à une valeur différente, telle que 6, 7 et 8 (Fig. 6C), pour distinguer le pH approprié pour maximiser les nutriments solubles extraits de la poudre de son de blé utilisée pour les champignons. cultivation. Dans ce cas, le poids maximal de la masse cellulaire fongique (10,3 g/l) et les NP MnO (13,3 g/l) ont été détectés à pH 6. De plus, la température optimale utilisée pour l'extraction WB a été déterminée à 50 °C, ce qui a produit le poids maximal de la masse cellulaire fongique (11, 5 g / l) et MnO NPs (14, 9 g / l) comme indiqué sur la figure 6D. Après cela, les conditions suffisantes pour extraire les nutriments solubles du son de blé ont finalement été préparées en mélangeant 50 g de son de blé avec 1 l d'eau distillée et le pH ajusté à 6 puis chauffé à 50 ° C pendant 24 h. Dans cette condition, le poids maximal de la masse cellulaire fongique et les NP MnO ont été enregistrés à environ 15,3 g/l et 22,35 g/l, respectivement ; qui a augmenté de deux fois par rapport aux conditions de base (BC).

L'optimisation des paramètres de fermentation est une restriction essentielle pour améliorer l'économie des bioraffineries. La méthodologie de surface de réponse (RSM) est une approche statistique appliquée pour optimiser et modéliser plusieurs variables. Il a été utilisé pour déterminer les conditions optimales du procédé en intégrant les conceptions expérimentales avec interpolation à l'aide de la première ou de la deuxième équation polynomiale38,39,40. Dans ce travail, la conception de Plackett-Burman a d'abord été utilisée pour améliorer les conditions de culture de la souche endophyte EG92 en détectant statistiquement les variables significatives. Le tableau 3 résume les variations de masse de cellules sèches de 20,3 à 41,30 g/l, reflétant l'importance d'étudier les conditions de culture pour optimiser la productivité de la biomasse la plus élevée. Le coefficient de détermination du modèle (R2) indique que 97,73 % de la variabilité de la réponse pourrait être décrite par ce modèle, alors que 2,27 % de la variation totale ne peut pas être décrite.

De plus, le rapport F calculé était supérieur à celui théorique pour le modèle de régression, ce qui indique sa signification (tableau 4). Les effets principaux calculés ont été représentés graphiquement sous forme de graphique, comme indiqué sur la figure 7A. Étant donné que toutes les variables affectent positivement le poids de la masse de cellules sèches, à l'exception de l'agitation, du pH et du CuSO4, elles ont des effets négatifs. En outre, différentes variables significatives ont la contribution de présence la plus élevée dans ce diagramme circulaire, telles que F3 (14 %), F8 (22 %) et F6 (45 %) ; ainsi, ces facteurs sont considérés comme les variables importantes pour augmenter la production finale de poids de masse de cellules sèches pour la souche endophyte EG92 (Fig. 7B).

Analyse statistique montrant les effets des variables testées sur la masse de cellules sèches de la souche entophytique de Trichoderma virens EG92 selon la conception de Plackett – Burman. (A) Diagramme à colonnes de l'effet principal calculé des variables testées, (B) Diagramme circulaire de la distribution en pourcentage de chaque variable, et (C) Le diagramme de Pareto représente la valeur p calculée et les niveaux de confiance.

De plus, le diagramme de Pareto graphique montre le classement de chaque variable estimée en utilisant le niveau de confiance (%) et la valeur p (Fig. 7C). Les variables non significatives et significatives ont été détectées simplement par le niveau de confiance calculé (%) puisque les variables significatives ont des niveaux de confiance allant jusqu'à 95 %, telles que l'âge de l'inoculum (98,11 %), le pH (99,4 %), la taille de l'inoculum (99,96 %). , et WBE (99,79%). Enfin, cette amélioration a été obtenue à l'âge des inoculums (48 h), agitation (150 RPM), pH 6, CuSO4 (0,01 g/l), température d'incubation (30 °C), WBE (30 %), glucose (10 g/ l), taille des inoculums (4%), et MgSO4 (0,1 g/l). Ces conditions ont augmenté la masse maximale de cellules sèches de la souche endophyte EG92 jusqu'à six fois (42,68 g/l) par rapport à l'utilisation du BC. Par la suite, les métabolites bioactifs fongiques ont été utilisés pour fabriquer des NP MnO qui augmentent jusqu'à cinq fois (55,29 g/l).

Deuxièmement, les trois facteurs indépendants sélectionnés (pH, WBE et taille des inoculums) ont été optimisés statistiquement via la conception de Box – Behnken pour produire un poids maximal de la biomasse fongique. Étant donné que les niveaux des variables les plus significatives variaient entre des valeurs faibles (−), moyennes (0) et élevées (+), tandis que les variables non significatives se stabilisaient à leurs valeurs. Le tableau 5 représente la matrice de conception pour les variables testées indiquant à la fois les valeurs codées et réelles en plus des poids de masse de cellules sèches expérimentales et prédites. L'optimisation des variables significatives affectant les poids de masse des cellules sèches a été réalisée via l'équation de régression qui a généré la relation de la variable de réponse aux niveaux codés des variables indépendantes (tableau * 8). Ces résultats montrent que trois variables indépendantes augmentent significativement les quantités de masse cellulaire sèche. Depuis, on observe une variation du poids massique des cellules sèches de 58,18 g/l (piste 2) à 86,89 g/l (piste 13). Ce modèle est significatif à un niveau de confiance élevé car la valeur F était plusieurs fois supérieure à celle tabulée. La probabilité p-value était également très faible (p ≤ 0,05). Le coefficient de détermination du modèle (R2) indique 96,47 % de la variabilité de la réponse, que ce modèle pourrait désigner. Dans le même temps, 3,53 % de la variation totale ne peut être définie (tableau 6). Une corrélation élevée (Adj. R2 = 0,90) indiquait également le degré de précision qui confirmait la haute signification du modèle.

De plus, le diagramme de Pareto (Fig. 8A) a été représenté graphiquement en utilisant le niveau de confiance (%), et les valeurs de p ont montré les rangs de chaque variable ; puisque les variables significatives ont des niveaux de confiance allant jusqu'à 95 %. L'ANOVA a déterminé le pourcentage de contribution de chaque variable et les interactions entre les variables testées. La figure 8B montre la contribution de présence la plus élevée de différentes variables, qui ont été enregistrées à X22 (40%), suivi de X32 (23%) et X12 (8%). De plus, la présence la plus élevée ayant contribué aux effets d'interaction des variables significatives a été enregistrée parmi X2X3 (16 %) et X1X2 (6 %). Ainsi, ces variables et leur mélange sont importants pour améliorer le poids de la masse cellulaire sèche produite pour la souche endophyte EG92. Un modèle polynomial du second ordre a été ajusté par Eq. (4), et les valeurs réelles ont été calculées à l'aide de l'équation. (5) pour prédire le point optimal. En conclusion, cette amélioration a été obtenue à pH 5,5, WBE (35 %) et taille des inoculums (10 %), ce qui a augmenté la masse maximale de cellules sèches de la souche endophyte EG92 jusqu'à 12 fois (89,63 g/l) par rapport à l'utilisation de BC. . Par la suite, les métabolites bioactifs fongiques ont été utilisés pour fabriquer des NP MnO qui ont augmenté jusqu'à 8 fois (82,93 g/l).

Analyse statistique des effets des variables significatives testées sur la masse de cellules sèches de la souche EG92 entophytique de Trichodermavirens, selon le plan expérimental de Box – Behnken. (A) Le diagramme de Pareto représente la valeur p calculée et le niveau de confiance (%), et (B) Le diagramme circulaire montre la distribution en pourcentage de chaque variable.

Dans ce travail, le système de fermentation submergée a été utilisé pour étudier la cinétique de croissance de la souche endophyte EG92 via le mode de fermentation discontinue dans un bioréacteur de 7 L. Étant donné que le système de fermentation submergé était considéré comme un processus simpliste qui offrait un meilleur contrôle. Pendant ce temps, l'augmentation de la production de champignons filamenteux a été influencée par de nombreux paramètres tels que la vitesse d'agitation et les débits d'air. Ainsi, pour maximiser la souche endophyte, le poids de masse des cellules sèches EG92 obtient donc le meilleur rendement en NP MnO. Les caractéristiques de mélange des différentes vitesses et durées d'aération/agitation ont été étudiées via sept stratégies de contrôle dans les modes de fermentation discontinue (BF) (Fig. 9). Les résultats cinétiques ont montré des variations de Xmax et Pmax, qui indiquaient les activités physiologiques les plus élevées en fonction des différents taux d'aération/agitation et du moment. Comme le montre la Fig. 9, le régime d'aération/agitation utilisé dans le cas B6 (débit d'air et agitation ajustés pour laisser le niveau d'OD n'est pas inférieur à 40 %) a produit les Xmax (145,63 g/l) et Pmax (99,52 g/l) les plus élevés. après 162 h à côté de μmax et YX/S ont été enregistrés respectivement à 0,084 et 7,65. Par conséquent, l'ajustement du niveau d'OD à ≥ 10 % est considéré comme un facteur important affectant la croissance de la souche endophyte EG92, qui augmente jusqu'à 21,08 % (145,63 g/l) que le BC. Par la suite, les NP MnO fabriquées à l'aide de ces concentrations de métabolites bioactifs ont augmenté jusqu'à dix fois (99,52 g/l) que la concentration basale de l'agent réducteur/coiffant. Au point final du mode de fermentation discontinue, les quatre stratégies d'alimentation testées ont été lancées par différents modes de fermentation discontinue. Ces quatre modes de fermentation discontinus testés (FBF) ont été mis en place par les ingrédients de milieu optimisés ou WBE, uniquement pour augmenter la production de croissance fongique. Comme le montre la figure 10, différentes stratégies d'alimentation ont été utilisées pour expliquer le comportement des cellules endophytes de la souche EG92 et des NP MnO produites. Les données les plus élevées ont été enregistrées en alimentant WBE via un régime d'alimentation à impulsions exponentielles (FB4). Depuis, Xmax et Pmax ont été enregistrés à 295,36 et 217,95 g/l, respectivement après 48 h à μmax (0,082) et YX/S (20,69). Ces résultats sont considérés comme uniques en ce sens qu'ils maximisent la production de biomasse endophyte de Trichoderma et donc la biosynthèse de MnO NP à l'aide de déchets, ce qui n'a jamais été fait auparavant à notre connaissance.

Effets de différents régimes d'aération et d'agitation et de son calendrier sur la croissance de la souche EG92 endophyte de T.virens, d'où le poids de masse des NP MnO fabriqués à l'aide d'un système de fermentation immergé via le mode batch dans un bioréacteur de 7 L. (B1); débit d'air démarré de 1 à 4,5 vvm/12 h et agitation démarrée de 100 à 800 rpm/6 h, (B2) débit d'air démarré de 0,5 à 2 vvm/6 h et agitation démarrée de 100 à 800 rpm/3 h, (B3) débit d'air démarré de 1,5 à 3,5 vvm/12 h et agitation démarrée de 50 à 250 tr/min/6 h, (B4) débit d'air démarré de 0,5 à 2,5 vvm/6 h et agitation constante à 400 tr/min, (B5) débit d'air constant à 2 vvm/ 12 h et agitation démarrée de 50 à 300 tr/min/6 h, (B6) débit d'air et agitation ajustés pour que le niveau d'O2 dissous ne soit pas inférieur à 10 %, et (B7) débit d'air et agitation ajustés pour que le niveau d'O2 dissous ne soit pas inférieur 40 %.

Étudiez les effets de différents modes de fermentation en discontinu sur la croissance de la souche EG92 endophyte de T. virens, d'où le poids de masse des NP MnO fabriqués à l'aide d'un système de fermentation submergé via le mode en discontinu dans un bioréacteur de 7 L. (FB1) alimentation constante pour le milieu entier, (FB2) alimentation par impulsions exponentielles pour le milieu entier, (FB3) alimentation constante pour WBE et (FB4) alimentation par impulsions exponentielles pour WBE.

Une technique d'optimisation est utilisée lors de la biosynthèse de n'importe quel nanomatériau pour trouver les conditions expérimentales idéales pour produire les résultats les meilleurs et les plus stables. Les systèmes d'optimisation traditionnels ignorent les interactions entre les variables indépendantes, et l'exécution de nombreuses expériences prend du temps et coûte cher. Dans notre travail, l'effet de différents paramètres sur la production de biomasse et le rendement des NP MnO a pu être mesuré par un plan expérimental statistique (méthode de Taguchi) pour trouver les meilleures conditions à l'aide de tableaux orthogonaux et d'une analyse de la variance. La conception expérimentale de Taguchi, également connue sous le nom de conception de paramètres robustes, peut comparer différentes conditions expérimentales et sélectionner celle qui présente le moins de variabilité comme étant la plus forte.

Ainsi, la méthode de conception de Taguchi est un outil d'optimisation statistique qui fournit des résultats simples, efficaces et systématiques pour maximiser la production26,41. Pour étudier les variables les plus influentes qui ont optimisé la production de NPs MnO en utilisant un extrait fongique comme agents réducteurs/coiffants et MnCl2·4H2O comme composé parent (précurseur), un plan expérimental de Taguchi (TD) a été prévu avec 25 pistes utilisant 6 facteurs à cinq les niveaux. Ensuite, le poids massique des NP MnO fabriquées par des champignons (réponse du modèle) a été déterminé pour calculer les rapports S / N les plus élevés pour chaque essai (Fig. 11G). Généralement, il existe des variations dans les augmentations de masse des NPs MnO de 160,45 ± 1,99 g/l (Trail 5) à 315,3 ± 0,19 g/l (Trail 19), de sorte que les variables testées augmentent les quantités de poids des NPs MnO de manière significative, comme indiqué dans ( Tableau 7).

Une évaluation statistique de l'influence des facteurs significatifs indiqués, y compris le métal Précurseur conc. (V1), agent réducteur/coiffant conc. (V2), température (V3), pH (V4), stabilisant conc. (V5) et le temps de réaction (V6) sur la production biogénique de NPs MnO ont été réalisés en utilisant le plan expérimental de Taguchi. (A) Graphique de réponse du rapport S/N pour les NP MnO fabriqués par des champignons, (B) Diagramme circulaire montrant la distribution en pourcentage de chaque facteur.

L'équation de régression a été générée par la réponse (variable dépendante) et les niveaux codés des variables indépendantes (tableau 8). Le coefficient de détermination du modèle R2 = 0,9814, ce qui indique que les 98,14 % de la variabilité de la réponse de ce modèle pourraient être désignés, tandis que 1,68 % de la variation totale ne peuvent pas être définis. Une corrélation élevée (Adj. R2 = 0,9751) indique également le degré de précision qui a confirmé la haute signification du modèle. Étant donné que le modèle était significatif parce que la valeur F était supérieure à la valeur tabulée plusieurs fois. De plus, le niveau de confiance calculé (%) et les valeurs de p ont montré les rangs de chaque variable puisque les variables significatives ont des niveaux de confiance allant jusqu'à 95 %. La figure 11H montre que la contribution de présence la plus élevée pour différentes variables a été enregistrée au temps de réaction (66 %), suivi de la température de réaction (17 %) et du pH de réaction (9 %). Ainsi, ces variables et leur mélange sont considérés comme importants pour augmenter le poids massique des NP MnO à l'aide de l'extrait endophytique de la souche EG92 de T. virens. Enfin, l'amélioration de la réaction des NP MnO fabriquées par des champignons a été obtenue avec MnCl2·4H2O en tant que composé parent (0,25 M), extrait fongique en tant qu'agents réducteurs/coiffants (100 %), pH de réaction ~ 5, température de réaction (60 °C ), temps de réaction (5 h) et extrait fongique comme agent stabilisant (20 %). Ainsi, le poids massique maximal des NP MnO fabriqués par des champignons a été augmenté jusqu'à 40 fois (395,36 g / l) par rapport au BC. Enfin, cette étude est considérée comme la première étude qui a fabriqué industriellement des NP MnO en utilisant des métabolites bioactifs extraits à l'aide d'endophytes Trichoderma virens par le biais de stratégies de biotraitement statistique. De plus, les NP MnO fabriquées ont été préparées biologiquement en utilisant les métabolites bioactifs extracellulaires de la souche endophyte EG92 comme agent de coiffage/réducteur et MnCl2·4H2O comme composé parent.

La figure 12 affiche les stratégies de biotraitement statistique appliquées pour augmenter la production du poids de masse de la souche endophyte EG92 et du poids de masse des NP MnO fabriqués par le champignon. Ces expériences ont été conçues pour optimiser les conditions de culture de la souche endophyte EG92 en utilisant des conceptions PB et BB. Ces cellules, et donc les NP MnO, ont ensuite été mises à l'échelle dans un bioréacteur semi-industriel utilisant un système de fermentation submergé en modes BF et FBF. Étant donné que le système de culture BF a été amélioré en utilisant plusieurs taux d'aération/agitation, le mode FBF a également été amélioré, en utilisant diverses stratégies d'alimentation pour l'ensemble du milieu ou WBE qui utilisaient le mode exponentiel ou pulsé. De plus, la réaction de fabrication des NP MnO a également été optimisée par TD. Généralement, ces stratégies statistiques ont un avantage important sur les méthodes conventionnelles. Les résultats finaux ont indiqué que la masse de cellules sèches et les productions de NP MnO fabriquées par des champignons ont augmenté, comme le montre la figure 12.

Résumé des stratégies de biotraitement appliquées pour optimiser le poids massique EG92 de la souche endophyte Trichoderma virens (g / l), ainsi que le poids massique des NP MnO fabriqués par des champignons (g / l) à l'aide de Plackett – Burman (PB), Box – Behnken (BB) et Taguchi (TD) plans expérimentaux. Mise à l'échelle de la production de masse fongique via un bioréacteur semi-industriel (7 L) par système de fermentation immergée via des modes de fermentation batch (BF) fed-batch (FBF) qui se comparent finalement aux conditions de base (BC).

À ce jour, aucune étude ne s'est penchée sur la biosynthèse des NP MnO en utilisant l'extrait endophyte de Trichoderma virens comme agent réducteur, coiffant et stabilisant, suivie d'une optimisation industrielle des variables opérationnelles à l'aide de diverses méthodologies expérimentales statistiques, puis d'une production à grande échelle via fed-batch. fermentation.

Différentes concentrations de NPs MnO fabriquées ont été préparées pour évaluer ses activités antagonistes et détecter MIC, MBC et MFC à l'aide de différents phytopathogènes. Le tableau 9 affiche le diamètre des zones d'inhibition qui s'exprime en millimètres. Dans l'ensemble, l'excellente CMI pour les NP MnO mycosynthétisées a été enregistrée contre les bactéries phytopathogènes à 210 µg/ml, mais contre les champignons phytopathogènes a été vérifiée à 330 µg/ml. Dans le cas des champignons phytopathogènes, les plus grandes zones d'inhibition ont été enregistrées contre Alternaria alternate (42,75 ± 3,96), suivies par Helminthosporium sp., (40,38 ± 2,58), cependant la plus faible mesurée contre Phytophthora arenaria à (28,13 ± 2,97). Cependant, contre les bactéries phytopathogènes, les plus grandes zones d'inhibition ont été enregistrées contre Erwinia amylovora (50,62 ± 2,34), suivie par Acetobacter pasteurianus (47,81 ± 6,34) et Erwinia carotovora (42,18 ± 2,56). Les résultats les plus faibles ont été notés contre Clavibacter michiganensis (33,75 ± 1,90) Erwinia persicina (39,37 ± 1,02). De plus, les valeurs obtenues de MBC étaient comprises entre 200 et 280 µg/ml, et les valeurs de MFC étendues à 340–440 µg/ml. Généralement, les NPs MnO myco-synthétisées ont des activités antagonistes rapides et plus efficaces contre les bactéries phytopathogènes que les champignons dans cette étude. Étant donné que nos NP MnO myco-synthétisées ont des activités antagonistes plus rapides et plus précises contre les bactéries phytopathogènes que les champignons, elles pourraient être utilisées à l'avenir comme nano-bio-pesticide alternatif pour contrôler diverses maladies pathogènes. Les NP MnO ont plusieurs propriétés uniques, telles que la capacité de pénétrer rapidement dans les cellules pathogènes en induisant des distorsions et une destruction de la membrane cellulaire, entraînant la mort des cellules microbiennes. Joshi et al. ont biosynthétisé des NP MnO2 à l'aide d'extrait de plante (extrait de feuilles de Datura stramonium comme agent réducteur), puis 10 mg/ml de MnONP ont été contrôlés contre les agents pathogènes humains et ont découvert qu'ils présentaient des effets antagonistes efficaces (30-44 mm)24. Pour biosynthétiser les NP ZnO, MnO2 et MgO, Ogunyemi et al., ont utilisé des bactéries rhizosphériques (souche Paenibacillus polymyxa Sx3). Leurs études ont révélé des effets inhibiteurs significatifs (13–17 mm) à une concentration de 16,0 µg/ml contre les bactéries phytopathogènes (Xanthomonas oryzaepv.oryzae)6. L'application aux plants de riz améliore également les facteurs de croissance et la biomasse des plantes tout en réduisant l'expression de la brûlure bactérienne des feuilles du riz, selon cette étude. Ainsi, ces nanoparticules métalliques sont non toxiques, biosûres et biocompatibles à faible dose. Enfin, l'application sur le terrain des NPs de MnO mycosynthétisées en tant que pesticide potentiel dans l'agriculture n'a pas encore été étudiée en profondeur jusqu'à présent.

Dans cette étude, des NP MnO synthétisées par mycosynthèse biologiquement en forme de tige avec une taille moyenne de cristallite d'environ 35 nm ont été formées en utilisant MnCl2.4H2O (précurseur) et l'extrait endophyte de la souche EG92 de Trichoderma virens (agents réducteurs, stabilisants et coiffants) qui ont cultivé dans un milieu de son de blé. Plusieurs approches d'optimisation statistique (plans Placket – Burman et Box – Behnken) ont été utilisées pour obtenir le poids de masse cellulaire fongique le plus élevé. Puisque la conception Placket-Burman a été utilisée pour cribler les principales influences sur la production de biomasse fongique. Les corrélations entre les paramètres importants et le poids de la biomasse fongique produite ont ensuite été corrélées à l'aide d'un plan factoriel de Box-Behnken. Les rendements des cellules EG92 et des NP MnO ont ensuite été augmentés industriellement à l'aide d'un mode discontinu de fermentation submergé avec des taux d'aération/agitation réglables, suivi d'un mode de fermentation discontinu alimenté utilisant un système d'alimentation à impulsions exponentielle. Après 48 h, cette ligne de production industrielle a donné Xmax (295,36 g/l) et Pmax (217,95 g/l). Le rendement des NP MnO a été multiplié par 40 (395,36 g/l) au-dessus des conditions de base en utilisant la conception de Taguchi pour améliorer la réaction de fabrication. Ces résultats sont uniques en ce sens qu'ils maximisent la production de biomasse endophyte de Trichoderma et, par conséquent, la biosynthèse des NP MnO à l'aide de déchets, ce qui n'a jamais été fait auparavant. Ce niveau de productivité de la biomasse en poids sec et des NP MnO n'a jamais été vu auparavant. Les activités antagonistes contre les phytopathogènes ont été étudiées, et Erwinia amylovora (50,62 ± 2,34) avait les zones d'inhibition les plus élevées, suivie par Alternaria alternate (42,75 ± 3,96). De plus, les valeurs de MBC pour les cellules bactériennes variaient de 200 à 280 µg/ml, tandis que les valeurs de MFC pour les cellules de champignons phytopathogènes variaient de 340 à 440 µg/ml. Enfin, ces NP MnO myco-synthétisées sont non toxiques, bio-sûres et bio-compatibles à faibles doses. En conséquence, il pourrait être utilisé comme nano-biopesticides dans l'agriculture.

Des feuilles saines d'aubergine noire égyptienne (Solanum melongena L.) ont été recueillies dans la ferme expérimentale de la ville de la recherche scientifique et des applications technologiques (SRTA-City), New Borg El-Arab City, Alexandrie, Égypte. Les champignons phytopathogènes testés (Fusarium solani, Fusarium moniliforme, Helminthosporium sp., Alternaria alternate, Aspergillus flavus, Aspergillus niger et Phytophthora arenaria) et les bactéries (Clavibacter michiganensis, Erwinia carotovora, Acetobacter pasteurianus, Erwinia amylovora et Erwinia persicina) ont été collectés du Département de développement des bioprocédés, GEBRI, SRTA-City, Égypte et Université de Zagazig, Faculté d'agriculture, El-Sharkia, Égypte.

Les feuilles des plantes ont été lavées trois fois à l'eau du robinet, puis immergées successivement dans de l'éthanol à 70 % pendant 5 min, de l'éthanol à 99 % pendant 2 min, et enfin les feuilles ont été trempées dans une solution de stérilisation à 6 % composée de (10 % NaHCO3 : 0,1 % Tween -20) pendant 2 min. Les feuilles stérilisées ont été lavées plusieurs fois avec de l'eau distillée stérilisée et laissées sécher dans une hotte à flux laminaire33. L'eau de rinçage finale a été étalée sur des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) contenant 200 g de pommes de terre, 20 g de dextrose et 20 g de gélose pour tester l'étape de stérilisation. Ces feuilles stérilisées ont été coupées et broyées avec une lame de scalpel stérile et broyées dans un mortier. En utilisant la méthode de dilution en série, 100 µl de l'extrait de feuilles dilué ont été préparés et étalés sur des plaques PDA et incubés à 30 °C pendant trois semaines. Les champignons entophytes ont été sélectionnés et purifiés à l'aide de plaques PDA. Enfin, les champignons entophytes purifiés ont été cultivés à l'aide d'un milieu de bouillon MGYP composé de 0, 3% d'extrait de malt, 1% de glucose, 0, 3% d'extrait de levure, 0, 5% de peptone et le pH final a été ajusté à 5, 9. Ensuite, ces cultures ont été incubées à 30 °C sous agitation (150 tr/min) pendant 72 h.

Les NP MnO ont été biosynthétisées en utilisant MnCl2·4H2O comme composé parent (précurseur) et l'extrait fongique comme agents réducteurs, stabilisants et coiffants. Les NP MnO ont été synthétisés en mélangeant 100 ml d'un extrait fongique avec 100 ml de MnCl2.4H2O 1 M, puis agités en continu à 60 ° C pendant 2 h (Incubation 1). La couleur de la réaction passe du jaune au brun jaunâtre en raison de la réduction des ions Mn. La quantité excédentaire d'extrait fongique (50 ml) a été ajoutée aux NP MnO produites et incubée dans des conditions d'agitation (200 tr/min) à température ambiante (28 ° C) pendant 5 h (Incubation 2). Ensuite, la couleur de la réaction passe du brun jaunâtre au brun rougeâtre en raison de la phase de coiffage (facilement reconnaissable à l'œil nu)6,27. Enfin, les NP MnO synthétisées par les champignons ont été centrifugées à 10 000 tr/min pendant 20 min et lavées trois fois avec de l'eau distillée et de l'éthanol. Ensuite, le résidu brun a été séché dans une étuve à 50 °C pendant 24 h. Un mortier et un pilon ont été utilisés pour écraser les NP MnO en poudre fine estimée (g/l) et stockées dans des flacons à bouchage. Grâce à la méthode de diffusion en puits, des champignons et des bactéries phytopathogènes ont estimé l'activité anti-phytopathogène des NP MnO biosynthétisées.

Les spectres d'absorption UV-Visible des NP MnO fabriquées par des champignons ont été mesurés sur un spectrophotomètre UV-Vis Shimadzu (Shimadzu, Tokyo, Japon). L'analyse des spectres FTIR pour la fraction extracellulaire fongique et les NP MnO fabriquées par des champignons ont été enregistrées sur (Shimadzu FTIR-8400 S, Japon), dans la gamme spectrale de 4000 à 400 cm-1. SEM: La structure morphologique des NP MnO a été détectée par une enquête au microscope électronique à balayage (SEM) à l'aide d'un (JEOL JSM 6360LA, Japon) avec son unité combinée EDX. La stabilité thermique des NP MnO fabriquées par des champignons a été déterminée à l'aide du modèle d'analyse thermogravimétrique (TGA) (TGA / DSC, Shimadzu, Japon), avec une vitesse de chauffage de 20 ° C / min sous flux d'azote. Les diagrammes de diffraction des rayons X (DRX) ont été obtenus à l'aide d'un (diffractomètre Shimadzu 7000, Japon), fonctionnant avec un rayonnement CuKα (λ = 0,15406 nm) généré à 30 kV et 30 mA avec une vitesse de balayage de 2°/min pour des valeurs de 2θ entre 20 et 80 °C. La taille moyenne des cristaux a été estimée à l'aide de la formule de Scherrer, comme indiqué dans l'équation. (1); Où Y est la taille des cristaux de MnO NPs fabriqués par des champignons, λ est une longueur d'onde du rayonnement CuKα, β est un demi-maxima pleine largeur du pic différent et θ est un demi-angle de diffraction.

Parmi cinq champignons endophytes isolés, un isolat est apparu la fréquence élevée de production de NP MnO fabriqués par des champignons, qui ont des activités anti-phytopathogènes efficaces, ont été choisis pour des investigations plus approfondies. Pour déterminer l'espaceur transcrit interne ribosomal (ITS), le génome fongique a été extrait et purifié à l'aide du kit d'ADN Minipreps obtenu auprès de (Promega, USA). La région ITS a été amplifiée par PCR avec 10 pmol d'amorce ITS1 (5′-CTTGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) et 10 pmol d'amorce ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′). Cette réaction a été mise en place en mélangeant 100 mg d'ADN fongique, 2,5 mM de chaque dNTP et 1,5 mM de MgCl2, avec 0,4 μl de 500 U Taq ADN polymérase42. La température de dénaturation initiale était de 95 ° C a été prolongée à 5 minutes et l'extension finale a été prolongée à 10 minutes à 72 ° C. Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse et visualisés à l'aide d'un trans-illuminateur UV. Selon la migration électrophorétique, les produits de PCR intéressés ont été élués du gel à l'aide de colonnes de centrifugation en silice (DNA Clean & Concentrator, Zymo Research). Le produit de PCR purifié a été séquencé directement selon le protocole recommandé par le fabricant (séquenceur d'ADN automatisé modèle 3130, analyseur génétique, Applied Biosystems, Hitachi, Japon). La séquence a été comparée aux séquences homologues en utilisant NCBI BLAST disponible sur http://www.ncbinlmnih.gov/. Un alignement de séquences multiples a été réalisé à l'aide du logiciel BioEdit (Hall, 1999) et un arbre phylogénétique a été construit à l'aide de la méthode de jonction de voisins (NJ) via un programme MEGA6.

Les métabolites bioactifs extraits ont été utilisés comme agents réducteurs, coiffants et stabilisants dans la fabrication de NP MnO. Ainsi, les fractions extracellulaires et cytoplasmiques ont été extraites pour détecter le compartiment cellulaire fongique compétent qui a produit les quantités les plus élevées de MnO NPs. La stratégie d'évaluation comparative des milieux de culture fongiques produisant le maximum de métabolites a également été étudiée. Tout d'abord, le milieu de croissance utilisé a été choisi comme indiqué ailleurs43,44,45 comme indiqué dans (tableau 1S, matériaux supplémentaires). Tous les milieux testés (50 ml) ont été préparés dans des flacons de 250 ml et autoclavés séparément pendant 15 min à 121 °C. Dans le cas du milieu de son de blé (WBM), l'extrait de son de blé (WBE) a été préparé en mélangeant 10 g de son de blé séché au four avec 90 ml d'eau distillée à 60 °C pendant 5 h, puis en incubant à 100 °C pendant 1h. Après cela, les nutriments extraits ont été séparés par un système de filtration à pH réglable de 7,046. Ce filtrat a été complété à un volume total de 100 ml avec de l'eau distillée et autoclavé séparément pendant 15 min à 121°C. Tous les milieux stérilisés ont été inoculés par des inoculums fongiques (5 %, v/v) et cultivés à 28 °C pendant 48 h (150 tr/min). Un système d'ultrafiltration a recueilli la biomasse fongique pour préparer la fraction extracellulaire. La fraction cytoplasmique a été extraite en mettant en suspension la biomasse fongique collectée dans du PBS 50 mM (pH 7, 0), puis soniquée à 40–50% de service pendant 25–30 rafales. Enfin, les fractions obtenues ont été centrifugées pendant 20 min à 10 000 tr/min, puis stockées dans des flacons à vis en verre propres à 4 °C. Les teneurs totales en protéines et en glucides de toutes les fractions ont été déterminées à l'aide d'un kit d'analyse colorimétrique des protéines Commercial-Rad et d'un kit d'analyse colorimétrique des glucides (Milpitas, CA 95035 USA). L'analyse phytochimique (teneurs en alcaloïdes, flavonoïdes, tanins, phénols, stéroïdes, saponines et terpénoïdes) a été détectée dans des études comparatives pour déterminer la fraction cellulaire compétente qui a agi comme agent réducteur, coiffant et stabilisant21. Enfin, la fabrication des réactions de MnO NPs a été mise en place comme décrit précédemment pour utiliser son poids sec dans les études comparatives.

La stratégie de biotraitement utilisée a commencé par le développement de conditions efficaces pour l'extraction des nutriments solubles de la poudre de son de blé. Étant donné que la méthode d'extraction a affecté les quantités de glucides, de protéines, d'acides aminés et d'autres oligo-éléments extraits du son de blé. Ainsi, il existe de nombreux facteurs tels que la poudre de son de blé (50, 100 et 150 g/l), le temps d'extraction (3, 12 et 24 h), le pH (6, 7 et 8) et la température d'extraction (30, 50 et 70 °C), ont été étudiés dans ces expériences. Deuxièmement, l'ensemble des ingrédients du milieu et les conditions de croissance fongique qui affectaient la production de biomasse ont été optimisés. En conséquence, des approches d'optimisation statistique successives (conceptions Plackett – Burman et Box – Behnken) ont été appliquées pour produire le poids de masse cellulaire fongique le plus élevé. Puisque la conception de Plackett-Burman a été utilisée pour cribler les facteurs importants qui affectent la production de biomasse fongique. Par la suite, la conception factorielle de Box – Behnken a été appliquée pour corréler les relations entre les facteurs significatifs et le poids de la biomasse fongique produite.

Cette conception expérimentale a été utilisée pour optimiser la production de biomasse fongique en étudiant l'effet de différentes variables de culture. Pour cette étude, la matrice utilisée était constituée de 12 expériences (sentiers) et de 9 variables indépendantes (âge des inoculums, agitation, pH, CuSO4, température d'incubation, WBE (%), glucose, taille des inoculums et MgSO4), dont chacune a un niveau bas (−) et niveau haut (+). Tous les essais ont été réalisés en triple pour détecter les variables significatives, et les valeurs moyennes de la production de biomasse fongique (réponse) ont été calculées. Les données finales ont été analysées statistiquement pour déterminer la valeur p et les niveaux de confiance à l'aide d'une analyse de régression standard. Par la suite, l'équation du modèle polynomial du premier ordre (équation 2) a été appliquée par un test F, où Y est la réponse, βo est l'ordonnée à l'origine du modèle, βi est l'estimation de la variable et Xi est la variable37,47. De plus, l'effet de chaque facteur a été déterminé à l'aide de l'équation. (3); où E(x) est la production de biomasse fongique, N est le nombre de traînées, M+ et M- sont l'effet de ce facteur à leurs niveaux.

Une conception à trois niveaux est une méthode statistique puissante utilisée pour optimiser le processus de fermentation microbienne en examinant l'interaction de facteurs importants sur la production de biomasse. Les trois paramètres indépendants choisis (pH, WBE et taille de l'inoculum) ont été testés à trois niveaux, codés -, 0, + pour les valeurs basses, moyennes et élevées, respectivement, pour calculer et estimer le point idéal pour la production maximale de biomasse. La variable de réponse a été ajustée via un modèle polynomial de second ordre (équation 4) pour corréler la réponse dépendante aux variables indépendantes à l'aide du logiciel Minitab 18.1. La qualité de l'ajustement de l'équation du modèle polynomial a été exprimée par le coefficient de R239,40. Les valeurs réelles de chaque facteur ont été déterminées à l'aide de l'équation de Myers et Montgomery (équation 5) ; où, Y est la réponse prédite, βo est l'ordonnée à l'origine, βi est le coefficient linéaire, βij est le coefficient quadratique, βii est l'interaction linéaire par linéaire entre Xi et Xj est les coefficients de régression, et XiXj sont les variables d'entrée qui influencent la variable de réponse Y37.

La souche fongique testée a d'abord été inoculée sur des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre et incubée à 30 ° C dans des conditions statiques pendant 14 jours. Ensuite, la suspension de spores a été préparée par une solution saline stérile (0,9%) dans des conditions aseptiques. Ces spores fongiques ont été comptées via un hémocytomètre pour préparer une suspension de spores appropriée pour l'étape d'inoculation. La culture secondaire a été préparée en inoculant 500 ml de milieu statistiquement optimisé dans des bouteilles agitées (1000 ml) avec 0,5 ml de suspension de spores fongiques fraîchement préparée (3 × 104 spores/ml) et incubée à 30 °C. Enfin, un bioréacteur BioFlo 310 de 7 L (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA), contenant 4,5 L de milieu stérile a été inoculé, puis la température et le pH ont été contrôlés à 30 °C et 5,5, respectivement. La caractéristique de mélange des taux d'aération/agitation et le moment ont été étudiés en utilisant la biomasse fongique et la production de NPs MnO comme réponses via sept stratégies de contrôle en mode de fermentation discontinue. Les stratégies testées ont été conçues comme décrit dans le tableau 10. Pendant les périodes de fermentation, les échantillons ont été prélevés pour calculer la production de biomasse et de MnO NPs.

Le point final de la période de fermentation a été détecté en augmentant la concentration d'oxygène dissous (DO), indiquant l'épuisement de la source de carbone48,49. Ainsi, à ce stade, les quatre stratégies d'alimentation ont été testées en utilisant différents modes de fermentation fed-batch. Quatre stratégies fed-batch testées ont été mises en place avec des ingrédients de milieu optimisés entiers ou WBE uniquement, comme décrit dans le tableau 11. Le débit d'air et la vitesse d'agitation ont été contrôlés pour que le niveau d'OD ne soit pas inférieur à 10 % dans tous les modes de fermentation fed-batch testés. Dans la phase logarithmique, la masse des cellules fongiques augmente avec le temps de façon exponentielle. Alors que le comportement de la croissance fongique et les NP de MnO produites ont été décrits et déterminés cinétiquement via différents modèles de fermentation utilisant différentes équations30,32. Le coefficient de rendement a été déterminé par la source de carbone consommée et la biomasse produite. Ainsi, de nombreux paramètres tels que le coefficient de rendement de la biomasse (YX/S), la biomasse maximale (Xmax), le rendement maximal des NP MnO (Pmax) et le taux de croissance spécifique maximal (µmax) ont été calculés.

La réaction de biosynthèse des NP MnO a été affectée par différents ingrédients et conditions de réaction tels que la concentration du précurseur (métal mère), la concentration de l'extrait fongique (agents réducteurs / coiffants), le pH, la température d'incubation, le temps d'incubation (temps de réaction) et l'agent stabilisant (extrait fongique). ). La conception de Taguchi a été appliquée pour maximiser la production de NP MnO via les étapes de fabrication biologique efficaces de cette stratégie d'optimisation. Ainsi, dans ces expériences, la conception de réseau orthogonal L25 Taguchi (5 ** 6) a été sélectionnée pour effectuer cette stratégie d'optimisation, tandis que le logiciel MINITAB 18 a été utilisé et les équations. (6–9), où le poids massique des NP MnO fabriqués par des champignons a été déterminé et les rapports signal sur bruit maximaux (S / N) ont été calculés pour chaque réaction de fabrication41. Enfin, le test de validation a été effectué sur la base des résultats de Taguchi et les rapports S/N prédits ont été calculés.

La concentration minimale inhibitrice (CMI) des NP MnO fabriquées par des champignons a été enregistrée et calculée. De plus, les activités antagonistes des NP MnO fabriquées par des champignons contre les phytopathogènes (bactéries et champignons) ont été observées et déterminées via une méthode de diffusion en puits23. Les champignons phytopathogènes étant cultivés dans du milieu de Czapek, celui-ci contenait (g/l) : NaNO3, 3,0 ; K2HPO4, 1,0; MgSO4∙7H2O, 0,5 ; KCl, 0,5; FeSO4∙7H2O, 0,01 ; et gélose, 15 (pH 4,8). De plus, des bactéries phytopathogènes ont été inoculées dans un milieu nutritif gélosé composé de (g/l) : [peptone 5, chlorure de sodium 5, extrait de bœuf 1,5, extrait de levure 1,5 et gélose 15 (pH 7,0)]. Différentes concentrations de NP MnO fabriquées par des champignons (10, 50, 90, 130, 170, 210, 250, 290, 330 et 370 µg/ml) ont été préparées et chargées dans des puits (0,5 mm). Ensuite, ces plaques ont été incubées à 30 ° C pendant 24 à 72 h et examinées pour les zones d'inhibition. Enfin, la concentration maximale bactéricide (MBC) et la concentration maximale fongicide (MFC) ont été vérifiées et déterminées50. Ces expériences ont été menées en triple, et ces données ont été analysées statistiquement via l'ANOVA unidirectionnelle à l'aide du logiciel Minitab.

L'article comprend les données utilisées pour étayer les résultats d'une étude. Les auteurs précisent qu'aucune autre approbation n'était nécessaire pour mener des recherches sur le matériel végétal, conformément aux directives locales et institutionnelles. Cet isolat a été soumis dans la base de données GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF429775) en tant que souche endophyte de Trichoderma virens EG92 avec le numéro d'accession MF429775 car il était complètement similaire à Trichoderma virens.

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Shahira H. El-Moslamy

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IS Yahia & HY Zahran

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Elbadawy A. Kamoun

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Elbadawy A. Kamoun

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IS Yahia & HY Zahran

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SHE a proposé l'idée et le concept de recherche, conçu un plan de recherche, réalisé la majorité des expériences, recueilli des données, des analyses, écrit/édité l'original et révisé le manuscrit. ISY : Analyse de données et consultation. HYZ : Analyse des données, consultation, révision du manuscrit final ; et EAK : Analyse des données, interprétation des données et rédaction/édition du manuscrit original et final. Le manuscrit final a été écrit, révisé et approuvé par tous les auteurs.

Correspondance à Shahira H. EL-Moslamy ou Elbadawy A. Kamoun.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

EL-Moslamy, SH, Yahia, IS, Zahran, HY et al. Nouvelle biosynthèse de NPs MnO à l'aide de Mycoendophyte : stratégies de biotraitement industriel et production à grande échelle avec son évaluation en tant qu'agents anti-phytopathogènes. Sci Rep 13, 2052 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28749-z

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Reçu : 16 mai 2022

Accepté : 24 janvier 2023

Publié: 04 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-28749-z

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