Modifications atypiques des cellules de Candida albicans traitées avec la Venetin

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2844 (2023) Citer cet article

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Dans la présente recherche, l'effet d'un complexe protéine-polysaccharide Venetin-1 obtenu à partir du fluide cœlomique du ver de terre Dendrobaena veneta sur les cellules de Candida albicans a été caractérisé. Le composé a détruit les cellules fongiques sans montrer de cytotoxicité pour les fibroblastes cutanés humains, ce qui a été démontré dans des études antérieures. Puisqu'il avait un effet sur la paroi et la membrane des cellules fongiques, ce complexe a été comparé à l'antibiotique antifongique fluconazole connu. Les deux préparations ont perturbé la division des cellules de levure et ont entraîné la formation d'agrégats et de chaînes de cellules non séparées, ce qui a été illustré par une coloration avec des fluorochromes. La coloration fluorescente de la paroi cellulaire au Calcofluor blanc a facilité la comparaison des types d'agrégats formés après l'action des deux substances. L'analyse effectuée avec l'utilisation du rouge Congo a montré que la vénétine-1 exposait les couches plus profondes de la paroi cellulaire, alors qu'aucun effet de ce type n'était visible après l'utilisation du fluconazole. L'analyse FTIR a confirmé les changements dans la couche de mannoprotéines de la paroi cellulaire après l'application du complexe Venetin-1. La coloration à la rhodamine 123 et l'utilisation de la cytométrie en flux ont permis de comparer les changements dans les mitochondries. Des mitochondries significativement allongées ont été observées après l'application de Venetin-1, mais pas après l'application de l'antibiotique classique. La microscopie à contraste de phase a révélé un élargissement des vacuoles après l'application de Venetin-1. L'analyse par cytométrie en flux de cellules de C. albicans traitées avec de la vénétine-1 et du fluconazole a montré que les deux substances provoquaient une diminution significative de la viabilité cellulaire.

Les avancées médicales se sont considérablement accélérées ces dernières années tant au niveau de la chirurgie que du traitement des maladies chroniques et des infections. Ainsi, le nombre de patients dont l'immunité est affaiblie à la suite d'un traitement chirurgical, d'une antibiothérapie, d'une chimiothérapie ou d'un traitement dans les unités de soins intensifs (USI) des hôpitaux a augmenté1,2,3,4. Le côté obscur de cette situation est le nombre croissant d'infections nosocomiales. Elles sont causées, entre autres, par la surconsommation d'antibiotiques, qui conduit au développement d'une résistance microbienne aux médicaments couramment utilisés5. Les infections par des agents pathogènes nosocomiaux prolongent le séjour du patient dans un établissement médical et augmentent les coûts de traitement2,3,6.

Les champignons Candida, en particulier Candida albicans, sont un exemple d'agents pathogènes provoquant de telles infections. C. albicans est un agent pathogène opportuniste vivant de manière commensale à la surface de la peau et des muqueuses et faisant partie de la microflore intestinale chez les sujets sains7,8,9. Chez les patients immunodéprimés, ce champignon provoque des infections de la peau et des muqueuses ainsi que des candidoses systémiques potentiellement mortelles et des infections systémiques7,10,11. Cette levure est le quatrième pathogène de soins intensifs le plus répandu aux États-Unis et le premier en Europe3,4. Les infections sanguines à Candida associées aux admissions aux soins intensifs représentent environ 40 % des cas, 9,3 % des patients développant une septicémie2.

C. albicans doit son succès en tant qu'agent pathogène à la grande plasticité du génome, à la capacité de créer des biofilms, à la production d'enzymes lytiques et à la capacité d'adhérer aux surfaces7,9,11,12,13. Les biofilms sont particulièrement dangereux pour les patients. Ils peuvent être formés sur des surfaces naturelles et artificielles. Les biofilms sont résistants à de fortes concentrations d'antibiotiques antifongiques, ce qui les rend difficiles à éliminer, et ils sont une source de cellules pathogènes qui peuvent créer de nouveaux foyers d'infection dans le corps7,14,15. On estime que le taux de mortalité chez les sujets infectés par Candida peut atteindre 40 %2,3,16,17.

Le fluconazole est l'un des antibiotiques les plus couramment utilisés dans le traitement de la candidose. C'est un antibiotique azolé qui agit en inhibant l'enzyme 14-α-stérol déméthylase impliquée dans la synthèse des stérols membranaires7. Cela entraîne une modification des propriétés et de la structure de la membrane cellulaire, ce qui entraîne une inhibition de la croissance du champignon. Malgré la faible toxicité du fluconazole pour les cellules hôtes, le médicament est de plus en plus signalé comme inefficace dans le traitement de la candidose7. Ceci est causé par le développement d'une résistance aux antibiotiques par les micro-organismes par le biais de mutations dans leur matériel génétique conduisant à une augmentation du nombre de pompes multi-drogues à la surface de leurs cellules7,18.

En raison de la tendance de C. albicans à développer une résistance aux antibiotiques, il est nécessaire de rechercher des préparations alternatives pouvant être utilisées dans le traitement de la candidose. L'environnement naturel, qui a inspiré la médecine naturelle pendant des centaines d'années, peut être utilisé comme source de telles substances. Les vers de terre sont des organismes utilisés depuis longtemps pour traiter les infections fongiques dans la médecine traditionnelle extrême-orientale. Ils ont également été utilisés pour traiter de nombreuses autres maladies, telles que la jaunisse ou les maladies cardiovasculaires, et pour augmenter l'immunité19,20. Les pâtes, poudres et extraits préparés à partir de vers de terre et de leurs symbiotes ont une activité documentée contre les levures et bactéries Candida20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Le liquide coelomique de vers de terre, les fractions séparées du liquide et les extraits de ces invertébrés présentent également une activité anticoagulante, anti-inflammatoire et antitumorale19,32,33.

Nos études ont montré que le complexe protéine-polysaccharide décrit précédemment comme une fraction du liquide cœlomique n'avait aucune activité cytotoxique contre les fibroblastes humains normaux34. Le complexe Venetin-1 a montré une activité antitumorale contre le cancer du poumon non petit35 et le cancer du côlon36 et a exercé un effet antiplaquettaire multi-voies sans coagulopathie ni cytotoxicité37. Le composé actif a été séparé du liquide cœlomique du ver de terre après élimination de sa cytotoxicité par incubation à température élevée33. Après ce processus, l'activité antitumorale et antifongique a été maintenue et les cellules normales ont été épargnées en même temps. En termes de chimie, la préparation avait la même composition à chaque point analysé, et a été caractérisée chimiquement dans les publications précédentes comme un composé protéine-polysaccharide et une microparticule de dimensions 58,23 ± 3,93 nm34,35.

Le complexe obtenu agissant sur la paroi cellulaire et la membrane de C. albicans, comme le montrent des publications antérieures, il a semblé judicieux d'analyser cet effet par rapport à l'antibiotique standard, qui interagit également avec la membrane cellulaire fongique. Compte tenu de la résistance croissante des micro-organismes aux antibiotiques, les résultats des études sur l'activité antifongique du complexe suggèrent que le complexe du liquide cœlomique peut être une préparation précieuse dans la lutte contre les maladies causées par les champignons du genre Candida.

Des vers de terre Dendrobaena veneta ont été utilisés dans cette recherche. Ces invertébrés ont été élevés dans des conditions supervisées dans le département d'immunobiologie de l'Université Maria Curie-Skłodowska à Lublin (Pologne). Les annélides ont été conservés dans des conteneurs d'une capacité de 3L. Les conteneurs ont été remplis de terre de compost et maintenus dans l'obscurité avec un flux d'air à 25 ° C et une humidité de 70 à 80 %. Les vers de terre étaient nourris trois fois par semaine avec des feuilles de thé vert, de la cellulose et des légumes bouillis. Seuls les vers de terre matures ont été sélectionnés pour les expériences.

Les vers de terre rincés à l'eau ont été maintenus sur de la lignine humide pendant 24 h. Le fluide cœlomique (FC) a été obtenu à partir de groupes de 10 individus immergés dans une petite quantité de NaCl à 0,9 % afin de maintenir la conductivité électrique. Le liquide a été obtenu après électrostimulation avec un courant de 4,5 V appliqué pendant 1 min. Le CF obtenu a été centrifugé (6000xg, 10 min) afin de séparer les coelomocytes. Le surnageant a ensuite été filtré à travers des filtres Millipore 0,22 et chauffé à 70°C pendant 10 min. Le CF acellulaire a ensuite été transféré dans un sac de dialyse avec un seuil de coupure de 12 à 14 kDa et dialysé pendant une nuit à 4 ° C contre de l'eau distillée. Le complexe stérile a été transféré dans des tubes Eppendorf, lyophilisé et stocké à -20°C. La concentration en protéines dans le complexe Venetin-1 a été déterminée avec la méthode de Bradford38.

L'isolat clinique de la souche de type sauvage de C. albicans utilisé pour l'analyse microbiologique a été offert par le professeur A. Kędzia du Département de microbiologie orale de l'Université médicale de Gdańsk. Avant les expériences, la culture fongique a été pré-cultivée dans un milieu Sabouraud liquide à 28 ° C. Après 24 h d'incubation, 30 µL de la culture de C. albicans (107 UFC en phase de croissance logarithmique) ont été ajoutés dans 150 µL de milieu pauvre YPD additionné de sulfate de streptomycine (Sigma) à une concentration finale de 0,17 mg mL−1 et Vénétine-1 ou fluconazole. Les concentrations finales de vénétine-1 et de fluconazole utilisées dans les expériences étaient de 25, 50 et 100 µg mL-1 et 5, 10 et 20 µg mL-1, respectivement. Les échantillons ont été incubés à 37 °C pendant 48 h sous agitation.

Les cultures cellulaires destinées à l'analyse par microscopie ont été préparées comme décrit dans la section « Préparation de la culture cellulaire de C. albicans avec la vénétine-1 et le fluconazole » de la section Matériels et méthodes. Des analyses de microscopie optique à contraste de phase ont été effectuées en utilisant des cellules de C. albicans non colorées. Quatre fluorochromes : le rouge Congo, le blanc Calcofluor, le Hoechst 33342 avec un mélange d'iodure de propidium et la rhodamine 123 ont été utilisés pour la microscopie à fluorescence. L'analyse par microscopie à fluorescence et l'analyse par contraste de phase ont été réalisées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (Carl Zeiss, Jena, Allemagne). Toutes les longueurs d'onde d'excitation utilisées dans l'analyse et les structures visualisées sont présentées dans le tableau 1.

Le blanc de calcofluor (Fluka) se lie à la chitine dans la paroi cellulaire fongique. Le fluorochrome (solution aqueuse à 20%) a été incubé avec une suspension 1:1 des cellules analysées pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité. Ensuite, 2 µL de la suspension ont été transférés sur une lame de microscope et observés. Les agrégats présents dans toutes les cultures ont été comptés après analyse de 1000 formes. L'expérience a été répétée trois fois. Les formes identifiées étaient des cellules uniques, des doublets, des triplés, des quadruplés, des chaînes, de petits agrégats (< 10 cellules), de grands agrégats (> 10 cellules) et des hyphes/pseudohyphes.

Le colorant rouge Congo (Sigma-Aldrich) a été utilisé pour visualiser les β-1,4 glucanes 1,- de la paroi cellulaire. Une solution aqueuse (2%) du colorant a été mélangée avec la suspension de cellules de C. albicans analysées dans un rapport 1:1. Après 3 min d'incubation dans l'obscurité à température ambiante, 2 µL de la préparation ont été transférés sur une lame et observés.

Un mélange de coloration Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) et iodure de propidium (Sigma-Aldrich) a été préparé et ajouté aux cultures fongiques dans un rapport 1: 1, puis incubé à 37 ° C pendant 5 min dans l'obscurité. 2 µL de la suspension cellulaire ont été analysés au microscope. Les colorants ont été utilisés pour visualiser le matériel génétique des cellules dans leur état actuel : les cellules régulières présentaient une fluorescence bleue des noyaux, les cellules apoptotiques présentaient une fluorescence blanche brillante du matériel génétique fragmenté et les cellules nécrotiques présentaient une fluorescence rouge39,40.

Le colorant Rhodamine 123 (ThermoFisher Scientific) est utilisé pour colorer les membranes des mitochondries fonctionnant correctement. Les mitochondries actives présentent une fluorescence verte. Les cellules dont le fonctionnement des mitochondries est perturbé n'ont pas de potentiel membranaire et n'émettent pas de fluorescence. La rhodamine 123 a été utilisée à deux concentrations : 120 µg mL-1 pour les cellules témoins et les cultures incubées avec Venetin-1 et 30 µg mL-1 pour les cellules traitées au fluconazole. L'utilisation de la plus faible dose de colorant pour le fluconazole était liée à l'augmentation de la perméabilité de la paroi cellulaire de C. albicans après un traitement antibiotique. Le contrôle négatif a été réalisé à l'aide d'azide de sodium, qui est un inhibiteur de la voie respiratoire mitochondriale41. Une solution d'azide de sodium à 1,3 % (Sigma) a été incubée avec les cellules témoins dans un rapport de 1:1 pendant 10 min à température ambiante. Toutes les cellules fongiques, c'est-à-dire le contrôle négatif et positif et les cellules traitées avec du fluconazole et de la vénétine-1, ont été incubées avec de la rhodamine 123 à différentes concentrations à 37 ° C pendant 20 min puis lavées 3 fois avec de l'eau stérile. Les échantillons ont été transférés sur des lames microscopiques et observés.

Les cellules de culture contrôle et les cellules traitées avec la Venetin-1 à la concentration de 100 µg mL-1 ont été centrifugées (température ambiante, 6000 xg, 10 min) et le surnageant a été jeté. Le culot a été mis en suspension dans 200 µL d'une solution de GH (composée de glucose, d'HEPES et d'eau stérile) et centrifugé à nouveau. Ensuite, le surnageant a été retiré et 20 µL de la solution de GH ont été ajoutés. Ensuite, les cellules ont été transférées dans une chambre de sublimation à une température de - 92 ° C pendant 12 min. Après cela, les cultures congelées ont été coupées dans la chambre de préparation et analysées avec un microscope à émission de champ ZEISS Ultra Plus (Carl Zeiss, Allemagne) avec une haute tension électronique (EHT) 5 kV et sous un grossissement de 30 000 × 39,42.

Les cultures cellulaires préparées comme décrit dans la section "Préparation de la culture cellulaire de C. albicans avec Venetin-1 et fluconazole" de Matériels et méthodes ont été centrifugées à température ambiante à 2500 x g pendant 10 min. Le surnageant a été jeté et le culot a été mis en suspension dans 70 µL d'une solution de fixation (10 ml de tampon phosphate pH = 7, 10 ml de glutaraldéhyde 10 %, 200 mg de saccharose) et incubé pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, la solution de fixation a été jetée et un tampon phosphate 0,1 M pH = 7 a été ajouté. Après centrifugation (2500 xg, 30 min, température ambiante), une solution d'OsO4 à 1,5 % a été ajoutée et incubée avec les cellules pendant 30 min à température ambiante. Après cela, les cellules fongiques ont été centrifugées et le surnageant a été éliminé. Ensuite, les cultures ont été lavées avec du tampon phosphate et centrifugées. Les cellules ainsi préparées ont été déshydratées dans une série de dilutions à l'acétone (15 %, 30 %, 50 %, 70 %, 100 %), transférées sur des platines SEM avec des disques de carbone, et séchées dans un dessiccateur pendant 24 h en présence de gel de silicone torréfié (pendant 2 h à 180 °C). Ensuite, les étages avec les sondes ont été recouverts d'une couche d'or à l'aide d'une machine de pulvérisation cathodique K550X (Quorum Technologies, Royaume-Uni) et observés à l'aide d'un microscope électronique à balayage Tescan Vega 3 (Tescan Orsay Holding, République tchèque)39.

L'analyse par cytométrie en flux utilisée dans notre recherche a permis de discriminer les cellules vivantes, apoptotiques et mortes. Les cultures cellulaires ont été préparées pour l'analyse comme décrit dans la section "Préparation d'une culture cellulaire de C. albicans avec Venetin-1 et fluconazole" de Matériels et méthodes. Ensuite, 20 µL de la suspension de culture cellulaire ont été ajoutés à 780 µL de réactif ViaCount (Luminex, USA) et incubés pendant 5 min dans l'obscurité à température ambiante. Les canaux d'enregistrement des émissions utilisés pour ViaCount étaient rouges et jaunes. 5000 cellules ont été comptées pour chaque échantillon. Les résultats ont été analysés avec le logiciel GuavaSoft avec la désignation de comptage Via et la viabilité comptée avec l'outil EasyFit, qui permet de distinguer les cellules viables et apoptotiques qui se chevauchent. L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée à l'aide d'un cytomètre en flux Guava easyCyte (Luminex, USA).

L'analyse par cytométrie en flux des mitochondries actives dans les cellules de C. albicans a été réalisée à l'aide de Rhodamine 123 (solution aqueuse 20 µg mL-1). La suspension cellulaire préparée comme décrit dans la section "Préparation de la culture cellulaire de C. albicans avec Venetin-1 et fluconazole" de Matériels et méthodes a été mélangée avec une solution de fluorochrome et incubée à température ambiante dans l'obscurité pendant 10 min41. Les canaux utilisés pour l'enregistrement des émissions étaient Forward Scatter et Green. Les résultats ont été analysés à l'aide du programme InCyte. L'analyse de la signification statistique a été effectuée à l'aide du programme Statistica et du test HSD Tuckey.

La spectroscopie FTIR est l'une des techniques de recherche les plus utilisées permettant l'observation de la structure chimique des composés organiques et inorganiques. Il est également largement utilisé dans les études de systèmes biologiques. Le principal avantage de la technique FTIR par rapport aux autres méthodes spectroscopiques est le fait que presque tous les composés chimiques présentent une absorption caractéristique du rayonnement dans la région spectrale IR ; par conséquent, ils peuvent être analysés à la fois qualitativement et quantitativement43. La spectroscopie infrarouge examine l'absorption du rayonnement associée à l'excitation des niveaux vibrationnels des molécules, ce qui facilite l'observation des changements dans le domaine des liaisons chimiques. Afin d'observer les changements qui se produisent dans les cellules de C. albicans après le traitement avec Venetin-1 à une concentration de 100 µg mL-1 et du fluconazole à une concentration de 20 µg mL-1, des spectres FTIR des échantillons préparés ont été obtenus. . Les tests ont été effectués en utilisant la technique ATR directement à partir de la surface de l'échantillon à température ambiante. Le spectromètre a été enregistré à l'aide d'un spectromètre FTIR Thermo Nicolet 8700 avec un accessoire ATR en diamant Smart Orbit™ équipé d'un détecteur DTGS (Deuterated Triglycine Sulphate). Les spectres ont été enregistrés dans le domaine de l'infrarouge moyen : 4000–650 cm−1 avec une résolution spectrale de 4 cm−1. Les spectres obtenus ont été soumis à une correction de la ligne de base et à une normalisation à l'échelle.

La coloration blanche Calcofluor résultant en une luminosité intense de la paroi cellulaire distingue différents agrégats dans la culture de cellules de C. albicans (Fig. 1). Des cellules de C. albicans ont été incubées avec de la vénétine-1 et du fluconazole à différentes concentrations ; ensuite, les agrégats individuels ont été comptés et leur pourcentage est illustré à la Fig. 2. Le nombre de cellules individuelles est passé de 43,72 % dans la culture témoin à 17,61 % dans la culture incubée avec Venetin-1 à une concentration de 100 µg mL−1 et à 10,79 % dans la culture traitée au fluconazole à une concentration de 10 µg mL-1. Deux fois plus de triplets fongiques ont été observés dans la culture incubée avec du fluconazole (à une concentration de 5 µg mL-1), par rapport à la culture témoin, soit 8,96 % et 4,70 %, respectivement. Il y avait également moins de quadruplés formés dans les cultures incubées avec la Venetin-1 et le fluconazole. Le pourcentage de petits agrégats (composés de moins de 10 cellules) ne différait pas entre la culture témoin et les cultures traitées avec Venetin-1 et fluconazole. Une augmentation significative a été observée dans la formation de gros agrégats (comprenant 10 cellules et plus) de 4,7 % dans la culture témoin à 18,24 % dans la culture incubée avec Venetin-1 à une concentration de 100 µg mL-1. Le pourcentage de chaînes formées dans la culture cellulaire incubée avec du fluconazole (20 µg mL-1) a également changé (de 1,34 à 17,14 %) par rapport à la culture témoin. Une augmentation significative du nombre d'hyphes/pseudohyphes a également été observée après l'incubation avec les deux préparations, atteignant 4,7 % dans la culture témoin, 30,19 % dans la culture incubée avec Venetin-1 (à 100 µg mL−1) et 22,86 % après l'incubation avec du fluconazole (à 20 µg mL-1) (Fig. 1).

Images d'agrégats de cellules de C. albicans après coloration au Calcofluor blanc : (A1)–(A2)-cellules de C. albicans témoins ; (B)- Cellules de C. albicans après traitement avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 ; (C)- Cellules de C. albicans après incubation avec du fluconazole à 20 µg mL-1. La barre d'échelle représente 5 µm.

Types d'agrégats dans la culture témoin de C. albicans et les cultures incubées avec différentes concentrations de vénétine-1 et de fluconazole. Les couleurs présentées sur le panneau supérieur correspondent aux couleurs des camemberts. La barre d'échelle représente 2 µm.

La coloration au rouge Congo du contrôle a montré que les cellules étaient rondes ou ovales avec une légère fluorescence rouge de la paroi cellulaire (Fig. 3 IA). Les cellules observées après l'incubation avec Venetin-1 à une concentration de 25 µg mL-1 étaient plus grandes, avec une fluorescence plus forte (Fig. 3 IB). L'image IC montre des changements dans la forme des cellules ainsi qu'une augmentation de leur taille après le traitement avec Venetin-1 à 50 µg mL-1 (Fig. 3 IC). Des cellules non séparées et une fluorescence rouge ont été observées sur toute la surface cellulaire après l'incubation avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 (Fig. 3 ID). Les cultures soumises au traitement au fluconazole à des concentrations de 5 et 10 µg mL−1 ont présenté des changements dans la forme et la taille des cellules et des chaînes ramifiées de cellules non séparées avec une fluorescence plus brillante que dans les cultures témoins (Fig. 3 I E - F). Les cultures incubées avec du fluconazole à 20 µg mL-1 présentaient en outre des connexions fluorescentes entre les cellules formant la chaîne (Fig. 3 IG). De plus, des pseudohyphes et des cellules avec des cicatrices de bourgeons étaient visibles dans cet échantillon. L'incubation avec toutes les concentrations de fluconazole n'a pas entraîné de fluorescence plus forte, comparée à celle observée après l'utilisation de Venetin-1.

Cellules IC albicans après l'incubation avec la Vénétine-1 et le fluconazole, colorées au colorant rouge Congo : (A) - cellules de la culture témoin ; (B)-cellules après l'incubation avec Venetin-1 à 25 µg mL-1 ; (C)-avec Venetin-1 à 50 µg mL-1 ; (D)-avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 ; (E)-cellules après l'incubation avec du fluconazole à 5 µg mL-1 ; (F)-avec du fluconazole à 10 µg mL-1 ; (G) - avec du fluconazole à 20 µg mL-1. La barre d'échelle représente 10 µm. II. Images Cryo-SEM de cellules de C. albicans ; A–A1-cellules de la culture témoin, B–B1-cellules après l'incubation avec Venetin-1 à 100 µg mL-1. La barre d'échelle représente 1 µm.

La technique Cryo-SEM a été utilisée pour visualiser la surface de la paroi cellulaire. Les images de la Fig. 3 II A, A1 montrent la surface de la paroi cellulaire de C. albicans dans la culture témoin. La surface était clairement bosselée. L'utilisation de Venetin-1 à la concentration la plus élevée (100 µg mL-1) a eu un effet de lissage de la surface de la paroi, ce qui peut indiquer une perturbation de la structure de la paroi du champignon (Fig. 3 II B, B1).

L'utilisation du mélange de Hoechst 33342 et d'iodure de propidium a facilité la discrimination entre les cellules normales, apoptotiques et nécrotiques. Les noyaux des cellules normales présentaient une fluorescence bleue et avaient une forme régulière. Les cellules apoptotiques avaient un matériel génétique fragmenté avec une fluorescence blanc-bleu vif, tandis que les cellules nécrotiques étaient caractérisées par la couleur rouge du matériel nucléaire.

Les cellules témoins de C. albicans avaient des noyaux ovales avec une fluorescence bleue (Fig. 4 I A1–A3 et II A1–A3). Les cellules traitées avec Venetin-1 à la concentration de 50 µg mL−1 avaient du matériel génétique réparti sur la jonction de deux cellules, c'est-à-dire les cellules mères et filles, suggérant des perturbations dans le processus de division cellulaire (Fig. 4 I B1–B3, marqué avec des flèches jaunes). Les cellules après l'incubation avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 ont montré une séparation incomplète des cellules les unes des autres, comme indiqué par les flèches blanches sur la Fig. 4 I C1 – C3. Les cellules apoptotiques avec un noyau fragmenté sont représentées sur la Fig. 4 I C1 – C2 et indiquées par une flèche orange.

Cellules de C. albicans après incubation avec Venetin-1 et fluconazole colorées avec un mélange de colorants Hoechst 33342 et iodure de propidium; I- A1–A3—cellules de culture de contrôle ; B1–B3-cellules après l'incubation avec Venetin-1 à 50 µg mL-1 ; C1–C3—avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 ; II- A1-A3-cellules témoins en culture, B1-B3-cellules après l'incubation avec du fluconazole à 10 µg mL-1, C1-C3-avec du fluconazole à 20 µg mL-1. Les flèches jaunes indiquent le matériel génétique non séparé des cellules après la division cellulaire ; les flèches blanches indiquent une séparation incomplète des cellules après division ; les flèches oranges montrent des cellules apoptotiques. La barre d'échelle représente 5 µm.

Les cellules après le traitement au fluconazole ont également montré une séparation incomplète entraînant la formation de chaînes, comme indiqué par les flèches blanches à la fois à 10 µg mL-1 (Fig. 4 II B1–B3) et à 20 µg mL-1 (Fig. 4 II C1–C3). La flèche orange sur la figure 4 II B2 indique le noyau d'une cellule apoptotique.

Les images présentées montrent l'effet de la division cellulaire perturbée après l'application de Venetin-1 et de fluconazole ; cependant, des perturbations dans la séparation des matières nucléaires au cours de la division cellulaire n'ont été observées qu'après l'application de Venetin-1. Après l'application de fluconazole, les cellules ont formé des chaînes, mais aucun matériel génétique n'a été observé dans la constriction intercellulaire. Ces observations indiquent un mécanisme d'action différent des deux préparations, malgré les observations microscopiques similaires.

Les cellules de C. albicans subissant le processus de bourgeonnement ont également été analysées par les techniques microscopiques SEM et Cryo SEM (Fig. 5). Une coupe transversale des cellules de culture de contrôle est montrée dans l'image Fig. 5A. Un bon bourgeonnement est visible, dans lequel le matériel génétique est entièrement séparé entre les cellules mères et filles (zone marquée d'un carré). Les cellules soumises à l'incubation avec la Venetin-1 à 100 µg mL-1 sont visualisées en image sur la Fig. 5B. Cette photo montre du matériel génétique incomplètement séparé entre la cellule mère et la cellule fille (marquée d'un cadre blanc), ce qui correspond aux images présentées sur la figure 4I. Les images SEM de la culture témoin montrent une division cellulaire normale avec un anneau de division clairement visible (Fig. 5C). L'image de la Fig. 5 D montre des cellules de levure après traitement avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 avec une séparation cellulaire incomplète. Les images SEM sont en accord avec les images obtenues avec la méthode Cryo-SEM.

Cellules de C. albicans imagées par Cryo-SEM (A, B) et SEM (C, D) : (A) - coupe transversale de cellules de C. albicans bourgeonnantes de la culture témoin ; (B) - coupe transversale de cellules bourgeonnantes de C. albicans après l'incubation avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 ; (C)- cellules de C. albicans de la culture témoin ; (D)-cellules après l'incubation avec Venetin-1 à 100 µg mL-1. La barre d'échelle représente 2 µm.

L'analyse réalisée à l'aide du colorant Rhodamine 123 a permis de visualiser les mitochondries des cellules témoins sous forme de petits points verts situés sur la périphérie interne des cellules (Fig. 6A). Les cellules du contrôle négatif incubées avec de l'azoture de sodium n'émettent pas de fluorescence observable (Fig. 6B1). L'image de la Fig. 6 B2 est équivalente à l'image B1 du microscope à lumière transmise. Après l'incubation avec Venetin-1 à 25 µg mL-1, des cellules avec des mitochondries allongées (Fig. 6C1 – C2, marquées de flèches blanches) et des cellules avec des mitochondries normales (Fig. 6C1 – C2, marquées de flèches jaunes) ont été observées. Après l'application de Venetin-1 à raison de 50 µg mL-1, les mitochondries étaient souvent visualisées sous la forme de longues structures lumineuses vertes pliées remplissant la lumière cellulaire (Fig. 6D1 – D2). La culture soumise à l'action de Venetin-1 à 100 µg mL-1 présentait en outre des cellules sans fluorescence interne, ce qui suggère que leurs mitochondries étaient inactives (Fig. 6E1 – E2, marquées de flèches rouges). Les cellules avec des mitochondries allongées sont marquées de flèches blanches dans les mêmes images. L'incubation avec du fluconazole n'a pas induit de changements significatifs dans la taille ou la localisation des mitochondries (Fig. 6F – H). Certaines cellules présentaient une fluorescence verte intense en raison de la forte absorption du fluorochrome, qui était causée par la perméabilité accrue de la membrane cellulaire après le traitement au fluconazole.

Coloration à la rhodamine 123 des cellules de C. albicans. (A) - cellules témoins positives avec de petites mitochondries rondes ; (B1)-(B2)-cellules témoins négatives traitées à l'azide de sodium. L'image (B2) est une visualisation des cellules au microscope à lumière transmise, équivalent de l'image (B1) du microscope à fluorescence. (C1)–(C2)—C. albicans traitées avec Venetin-1 à 25 µg mL−1, (D1)–(D2)—avec Venetin-1 à 50 µg mL−1, (E1)–(E2)—avec Venetin-1 à 100 µg mL− 1; (F)–C. albicans traitées avec du fluconazole à 5 µg mL-1, (G)—avec du fluconazole à 10 µg mL−1, (H)—avec du fluconazole à 20 µg mL−1. Les flèches jaunes montrent des cellules avec une forme normale de mitochondries ; les flèches blanches indiquent les cellules avec des mitochondries allongées ; les flèches rouges indiquent les cellules qui n'émettent aucune fluorescence interne en raison de mitochondries inactives. La barre d'échelle représente 10 µm.

La cytométrie en flux a été utilisée pour analyser les mitochondries actives avec la rhodamine 123, et les résultats sont présentés sur la figure 7a. Les tracés de points supérieurs montrent les différences entre les cultures dans les régions fermées : R1 - cellules régulières, R2 - agrégats et R3 - cellules avec des mitochondries actives. Dans la région R3, qui n'est pas contenue dans R1, les mitochondries des cellules sont anormales. Le pourcentage de cellules actives (Gate R3) dans toutes les cultures était similaire : 60,9 % dans la culture témoin, 64,34 % après l'incubation avec Venetin-1 (à 100 μg mL-1) et 66,22 % dans le traitement au fluconazole (à 20 µg mL−1). Une différence significative a été notée dans le nombre de cellules régulières après le traitement avec Venetin-1 (36,1%) par rapport aux cellules de culture contrôle (52,7%) et aux cellules traitées avec du fluconazole (57,64%). Les changements dans la porte R2 étaient également clairement visibles, avec des valeurs de 6,38 % dans la culture témoin, 8,42 % dans les cellules traitées avec Venetin-1 et 0,22 % dans la culture incubée avec du fluconazole.

(a) Analyse par cytométrie en flux de mitochondries actives avec Rhodamine 123. Dot-plots de la culture témoin, cellules après le traitement avec Venetin-1 à 100 µg mL-1, et dans la variante avec fluconazole à 20 µg mL-1. R1- cellules avec des mitochondries régulières ; R2- granulats ; Cellules R3 avec mitochondries actives. ( b ) Régions fermées après analyse par cytométrie en flux: cellules R1 avec mitochondries régulières; R2- granulats ; Cellules R3 avec mitochondries actives. Les histogrammes présentent le profil des cultures cellulaires dans les régions fermées. Vert - échantillon témoin, rouges - globules après le traitement à la Vénétine-1 à 100 µg mL-1, violets - cellules soumises au fluconazole à 20 µg mL-1.

La dispersion latérale concerne la complexité ou la granularité de la cellule, y compris les mitochondries. Les histogrammes (Fig. 7b) présentent différents profils dans la culture cellulaire incubée avec Venetin-1, ce qui indique que la structure des mitochondries a changé après le traitement avec la préparation. Les observations n'ont pas montré de changements dans la morphologie mitochondriale après le traitement au fluconazole, par rapport à la culture fongique témoin.

La microscopie à contraste de phase est une méthode utile pour l'observation d'objets qui ne présentent pas de contraste naturel, y compris les vacuoles cellulaires. L'image microscopique des cellules témoins de C. albicans a révélé des cellules ayant la forme ovale correcte (Fig. 8A1–A2). Les cellules exposées au complexe Venetin-1 aux concentrations de 25, 50 et 100 µg mL−1 étaient caractérisées par des vacuoles agrandies observées dans les cellules blastoconidies et hyphes (Fig. 8B1–B2, C1–C2, D1–D2, les vacuoles modifiées sont indiquées par des flèches). De plus, les vacuoles altérées étaient plus nombreuses et remplissaient la majeure partie de la cellule traitée (Fig. 8B2, D1 – D2). À son tour, le fluconazole n'a provoqué la formation de vacuoles agrandies dans les cellules de C. albicans à aucune des concentrations utilisées (5, 10, 20 µg mL−1), mais il y avait des cellules avec de nombreuses granularités et une taille significativement agrandie, par rapport à les cellules témoins (Fig. 8E1–E2, F1–F2, G1–G2).

Microscopie à contraste de phase des cellules de C. albicans. (A1)–(A2)—C. cellules témoins albicans; (B1)–(B2)—C. albicans après l'incubation avec Venetin-1 à 25 µg mL-1 ; (C1)-(C2)-avec Venetin-1 à 50 µg mL-1 ; (D1)-(D2)-avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 ; (E1)–(E2)—C. albicans après l'incubation avec du fluconazole à 5 µg mL-1 ; (F1)-(F2)-avec du fluconazole à 10 µg mL-1 ; (G1)–(G2)—avec du fluconazole à 20 µg mL−1. Les flèches indiquent des vacuoles élargies dans les cellules de C. albicans après l'action du complexe Venetin-1. La barre d'échelle correspond à 5 µm.

La technique de cytométrie en flux a été utilisée pour analyser la viabilité des cellules traitées avec Venetin-1 et fluconazole (Fig. 9). L'image de cytométrie en flux des cellules de culture de contrôle est montrée sur l'image IA ; la viabilité a été estimée à 76,68 %. Les images des Fig. 9B1 à B3 montrent les données obtenues à partir de l'analyse des cultures cellulaires incubées avec Venetin-1 aux concentrations finales de 25 µg mL-1 (Fig. 9a B1), 50 µg mL-1 (Fig. 9a B2) , et 100 µg mL−1 (Fig. 9a B3). Le pourcentage de cellules apoptotiques était de 17,18 % après le traitement avec la Venetin-1 à 25 µg mL−1 (Fig. 9a B1), 56,91 % à 50 µg mL−1 (Fig. 9a B2) et 50,78 % à 100 µg mL−1. −1 (figure 9a B3). L'image de la Fig. 9a B3 montre un groupe séparé de cellules mortes. Les diagrammes en points sur les Fig. 9a C1 – C2 et C3 présentent les données obtenues après l'analyse des cellules incubées au fluconazole à des concentrations de 5, 10 et 20 µg mL-1. Le pourcentage de cellules apoptotiques augmentait avec l'augmentation de la concentration de fluconazole et s'élevait à 22,11 % dans la culture cellulaire incubée avec du fluconazole à 5 µg mL-1, 26,88 % à 10 µg mL-1 et 58,41 % à 20 µg mL-1. La figure 9b montre le nombre total de cellules témoins et dans les cultures soumises aux différentes concentrations de vénétine-1 et de fluconazole. Il y avait une différence significative entre les cellules traitées et non traitées.

( a ) Données de cytométrie en flux de cultures cellulaires de C. albicans : ( A ) - culture cellulaire témoin ; (B1)-culture cellulaire traitée avec Venetin-1 à 25 µg mL-1, (B2)-avec Venetin-1 à 50 µg mL-1, (B3)-avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 ; (C1) - culture cellulaire traitée au fluconazole à 5 µg mL-1 ; (C2)—avec du fluconazole à 10 µg mL−1, (C3)—avec du fluconazole à 20 µg mL−1. La couleur rouge correspond aux cellules viables et la couleur noire indique les cellules apoptotiques. (b) nombre total de cellules dans les cultures. Témoin—cellules de C. albicans témoins ; V25, V50, V100—C. cellules albicans traitées avec Venetin-1 à 25, 50, 100 µg mL-1 ; FL5, FL10, FL20 - cellules traitées au fluconazole à 5, 10, 20 µg mL-1 ; *** P < 0,01 (test de Tukey HSD).

Trois régions spectrales ont été analysées dans le spectre FTIR : dans la plage de 3200–2800 cm−1, 1720–1400 cm−1 et 1200–950 cm−1 (Fig. 10). Des signaux caractéristiques des vibrations correspondant aux liaisons apparaissant dans les lipides ont été observés dans la plage de 3200 à 2800 cm−1 dans le spectre FTIR. La plage de 1720 à 1400 cm-1 présentait des pics correspondant aux vibrations caractéristiques des liaisons apparaissant dans les protéines, tandis que des bandes caractéristiques des polysaccharides ont été observées dans la plage de 1200 à 950 cm-1. Les tests ont montré une augmentation des signaux dans la région de 2800 à 3500 cm-1 après le traitement de l'échantillon de C. albicans avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 (Fig. 10). Une chute significative des signaux à 900–1800 cm−1 a également été observée. Dans le cas du traitement de l'échantillon de C. albicans avec du fluconazole 20 µg mL-1, une diminution de l'intensité du signal uniquement dans la plage de 1800 à 1200 cm-1 a été observée. Sur la base des données de la littérature, des signaux sélectionnés ont été analysés avec l'attribution de liaisons chimiques caractéristiques. Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

Spectre FTIR pour la culture témoin de C. albicans (Control) et après le traitement avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 (V100) et fluconazole à 20 µg mL-1 (FL20).

Il a été révélé dans des études antérieures que le complexe obtenu à partir du fluide cœlomique de D. veneta agit sur la paroi cellulaire et la membrane de C. albicans. Son effet a été comparé à celui du fluconazole dont l'action est bien connue. Le fluconazole est un médicament antifongique azolé du groupe des dérivés triazolés. Le mécanisme d'action des médicaments appartenant à ce groupe de composés synthétiques est basé sur l'inhibition de l'enzyme responsable de la biosynthèse de l'ergostérol, qui est l'un des composants qui construisent la membrane cellulaire fongique10,45. Cette perturbation métabolique augmente la perméabilité de la membrane cellulaire. La membrane cellulaire perd ses fonctions protectrices et la cellule cesse de croître, ce qui entraîne la mort du champignon.

Les médicaments et antibiotiques actuels deviennent de moins en moins efficaces contre les agents pathogènes. Ceci est lié au fait que les champignons développent une résistance aux antibiotiques contre des médicaments couramment utilisés tels que les azoles46. Le fluconazole est un médicament de premier choix dans le traitement antifongique. Une prise prolongée ou de nombreux traitements avec cet antibiotique peuvent entraîner une résistance à Candida47,48,49. Le fluconazole est utilisé pour la prophylaxie des mycoses chez les patients immunodéprimés, y compris les patients dans les unités de soins intensifs, les patients ayant subi une greffe d'organe et ceux subissant une chimiothérapie et une radiothérapie. Il a été rapporté que les isolats cliniques de C. albicans sont résistants au fluconazole pendant env. 30–40 %50,51. Il a été démontré qu'il existe un besoin urgent de développer de nouvelles préparations antifongiques pouvant être administrées aux patients infectés par C. albicans.

L'environnement naturel a toujours été une source d'inspiration à la recherche de substances aux propriétés bénéfiques. On les trouve dans tous les règnes du vivant : bactéries et champignons produisent des antibiotiques, tandis que des huiles essentielles et diverses molécules favorables peuvent être extraites des plantes45. Les animaux produisent également des substances qui ont été améliorées au cours de leur évolution pour les protéger des maladies. Les vers de terre, qui comptent parmi les animaux qui vivent le plus longtemps sur Terre, sont de tels organismes.

Dans nos études précédentes34, nous avons décrit des cellules de C. albicans colorées avec le fluorochrome blanc Calcofluor après l'action de la fraction protéique-polysaccharidique du fluide cœlomique de vers de terre. Il a été observé que la paroi cellulaire se colorait de manière inégale, indiquant une épaisseur différente de la couche de chitine dans la paroi cellulaire des cellules de levure traitées avec l'agent actif. Dans la présente étude, la formation de différents agrégats cellulaires a également été imagée au microscope. Le type et la quantité d'agrégats multicellulaires ont été analysés à la fois après l'incubation avec le complexe et après l'incubation avec le fluconazole. Ces analyses ont montré des différences dans le nombre de formations multicellulaires, ce qui indique un mécanisme d'action différent contre la paroi cellulaire de C. albicans. Ceci a également été confirmé par les autres analyses.

Le fluorochrome rouge Congo a été utilisé simultanément dans les analyses. Il peut former un complexe avec le (1,3)-β-glucane, ce qui rend la surface des parois cellulaires fongiques fluorescente en rouge sous un microscope à fluorescence. Le complexe Venetin-1 a provoqué une exposition au (1,3)-β-glucane, tandis que le fluconazole n'a pas exposé ce composant de la paroi cellulaire. Une légère fluorescence a été observée uniquement dans les cicatrices de division. Cela pourrait être lié au phénomène décrit par Pfaller et Riley52 selon lequel les cellules de C. albicans traitées au fluconazole contiennent significativement moins de glucane dans leurs parois. De nombreuses recherches ont étudié l'action synergique de divers composés avec le fluconazole pour exposer la couche de β-glucane47,53,54,55. Dans notre cas, cette exposition n'a été observée qu'après l'action du complexe, ce qui a été confirmé par Cryo-SEM. L'aplatissement de la couche la plus externe des cellules traitées par Venetin-1 peut indiquer une destruction de la couche de mannoprotéines sous laquelle se trouve la couche de β-glucanes, ce qui explique la fluorescence rouge observée après l'utilisation du fluorochrome rouge Congo. La reconnaissance du composant β-glucane de la paroi cellulaire fongique est un élément clé du système immunitaire de l'hôte ; par conséquent, les composés qui exposent le glucane peuvent devenir des médicaments précieux53,56.

Les tests spectroscopiques FTIR de C. albicans effectués après l'application de Venetin-1 ont montré une diminution de l'intensité du signal dans la plage de 1720–1400 cm−1 et 1200–950 cm−1. Ces bandes correspondent à des vibrations caractéristiques des liaisons chimiques trouvées dans les protéines et les polysaccharides, composants de la paroi cellulaire de C. albicans. La diminution de l'intensité des pics caractéristiques des protéines peut indiquer une destruction de la couche de mannoprotéines de la paroi cellulaire de C. albicans suite à l'action de la Venetin-1. Une diminution de l'intensité des signaux caractéristiques des polysaccharides, qui sont également un composant de la paroi cellulaire de C. albicans, a également été observée. Les images Cryo-SEM ont également montré un tel effet de destruction de la paroi cellulaire. Les études spectroscopiques FTIR ont également montré une augmentation de l'intensité des signaux correspondant aux vibrations caractéristiques des liaisons se produisant dans les lipides. Ceci confirme l'hypothèse concernant la destruction de la couche de mannoprotéines et de la couche de β-glucane de la paroi cellulaire de C. albicans et l'exposition de la couche lipidique de la membrane cellulaire.

L'effet du complexe sur la paroi cellulaire et la membrane des cellules de C. albicans peut être vu dans l'analyse des cellules fongiques à l'aide de la microscopie à contraste de phase, où des cellules avec des vacuoles anormalement agrandies ont été observées, suggérant des changements dans la perméabilité de la membrane. Aucun effet de ce type n'a été observé après l'incubation des cellules fongiques avec du fluconazole, ce qui indique un mécanisme d'action différent de cet antibiotique. Compte tenu de nos études antérieures, qui ont montré que la lysénine et la protéine 2 apparentée à la lysénine sont les principales protéines construisant le complexe39, la théorie sur les modifications de la perméabilité de la membrane cellulaire est compréhensible. On sait que les protéines de lysénine sont principalement impliquées dans la défense contre les agents pathogènes eucaryotes et procaryotes. La lysénine se lie au récepteur membranaire sphingomyéline. Lors de la fixation à la membrane après changement conformationnel, l'oligomère est incorporé dans la membrane57.

Les troubles de la division cellulaire ont également été analysés à l'aide d'un mélange de Hoechst et d'iodure de propidium, qui peut marquer le matériel génétique et montrer des cellules apoptotiques et nécrotiques. Lors de la division correcte dans la cellule souche, la division mitotique du noyau en deux cellules a lieu. Un noyau, avec une partie du cytoplasme, diffuse dans le renflement résultant appelé bourgeon. Le bourgeon se développe progressivement et est séparé de la cellule souche par la paroi cellulaire. Dans les cellules traitées avec le complexe de fluide cœlomique, du matériel génétique non distribué a souvent été observé entre les cellules mères et filles. Les cellules filles se sont développées sans séparation de la cellule mère et le matériel nucléaire était visible dans la constriction entre les cellules. Cet effet n'a pas été observé dans le cas de l'incubation avec le fluconazole. Les sections de cellules fongiques traitées avec Venetin-1 et imagées par Cryo-SEM et SEM ont montré une séparation cellulaire incomplète pendant le bourgeonnement, par rapport aux cellules témoins, où la paroi cellulaire et la membrane séparaient clairement les cellules pendant la division. Après l'action du complexe, la cellule fille a atteint une grande taille, incapable de se détacher de la cellule mère, et en conséquence, des doublets cellulaires avec une constriction entre les cellules étaient visibles. Cela indique une division anormale de la matière nucléaire avec une perturbation simultanée du système de paroi et de membrane. La cellule s'est développée avec un déficit de composants nécessaires pour compléter la division de la cellule fille. Les cellules de C. albicans traitées au fluconazole ont subi une division avec séparation complète du matériel nucléaire entre les cellules, ce qui est confirmé par les données de la littérature34.

Les données obtenues après la coloration à la rhodamine 123 ont montré que les cellules de C. albicans traitées à la Venetin-1 présentaient des changements clairement visibles dans la forme des mitochondries et étaient caractérisées par une perte de potentiel de membrane mitochondriale. Les recherches menées par Fiołka et al.39 ont démontré que les cellules fongiques traitées avec le complexe avaient des niveaux élevés d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et un niveau plus élevé de protéines impliquées dans la dégradation des ROS. Le stress oxydatif peut endommager l'ADN, les protéines et les composés lipidiques des structures cellulaires58. Une augmentation du niveau de ROS dans la mitochondrie conduit à l'ouverture des canaux ioniques de la membrane mitochondriale et, par conséquent, à un phénomène appelé RIRR (libération de ROS induite par ROS), où la perturbation du potentiel de la membrane mitochondriale entraîne une production plus élevée de ROS dans le transport d'électrons chaîne59,60. Le stress oxydatif peut entraîner l'apoptose ou la nécrose des cellules, et les deux modes de mort cellulaire après le traitement de C. albicans avec le Ventin-1 (précédemment décrit comme fraction de fluide coelomique) ont été observés34,39,60. Les cellules de C. albicans traitées au fluconazole n'ont présenté aucun changement dans la morphologie des mitochondries lors de la coloration à la rhodamine 123. L'effet sur les mitochondries exercé par le stress oxydatif induit par le traitement au fluconazole est basé sur une altération de leur fonction en supprimant le transport d'électrons mitochondrial, qui est réversible61,62,63,64. La perte temporelle de la fonction mitochondriale est décrite dans la littérature comme le mécanisme de la résistance au fluconazole62,65.

Le complexe Venetin-1 et le fluconazole ont induit la formation d'agrégats multicellulaires ; cependant, la cytométrie en flux a révélé des différences entre les cultures cellulaires. L'analyse de la viabilité de C. albicans a été effectuée uniquement dans des cellules qui ne formaient pas de grands agglomérats ou de structures multicellulaires complexes, car la conception du cytomètre permet des analyses de cellules individuelles. Cependant, dans le cas de l'action du complexe et de l'action du fluconazole, l'effet de formation d'agrégats est similaire et les résultats de la cytométrie en flux peuvent être comparés les uns aux autres, car des paramètres d'analyse identiques ont été appliqués dans chaque expérience.

L'analyse des mitochondries actives réalisée par cytométrie en flux a montré des différences entre les cultures cellulaires traitées avec la Venetin-1 et le fluconazole. Malgré les niveaux similaires de cellules avec des mitochondries actives, le traitement avec le complexe de fluide cœlomique a abaissé le pourcentage de cellules régulières. Cela indique que la vénétine-1 a provoqué des altérations dans les mitochondries, contrairement au fluconazole. Ceci suggère que le mécanisme d'action de Venetin-1 diffère de celui du fluconazole. Les résultats de cytométrie appuient les observations des cellules colorées à la Rhodamine 123 examinées par microscopie à fluorescence, en particulier l'élongation des mitochondries dans les cultures traitées avec Venetin-1 et aucun effet visible sur les mitochondries après l'incubation avec le fluconazole.

L'analyse de viabilité cellulaire réalisée par cytométrie en flux a montré un niveau similaire de cellules apoptotiques dans les cultures incubées avec Venetin-1 à 100 µg mL-1 et fluconazole à 10 µg mL-1. Les données obtenues dans cette expérience ont également montré que la concentration la plus élevée de vénétine-1 provoquait la mort cellulaire nécrotique, ce qui n'a pas été observé après le traitement au fluconazole. Les deux préparations ont considérablement réduit le nombre de cellules, par rapport à la culture témoin.

Dans la recherche de nouvelles thérapeutiques à utiliser dans le traitement des maladies infectieuses, le problème clé est l'absence de cytotoxicité qui limiterait leur applicabilité. Dans le cas du fluconazole, des rapports font état de son hépatotoxicité et de sa neurotoxicité66,67 ainsi que d'effets cytotoxiques et génotoxiques sur la lignée cellulaire de rein de singe68 et sur des cultures de cellules mononucléaires du sang périphérique humain69. À leur tour, nos recherches antérieures indiquent que le liquide cœlomique de D. veneta traité thermiquement et la vénétine-1 n'ont pas d'effets cytotoxiques contre les fibroblastes humains70, les cellules épithéliales humaines normales du côlon (CCD 841 CoTr)36, le plasma humain riche en plaquettes37 et les bronches humaines. cellules épithéliales (BEAS-2B)35. Lors de la recherche de nouvelles thérapeutiques à usage médical, il faut tenir compte non seulement de l'action efficace et de l'absence de cytotoxicité, qui sauve les cellules normales, mais aussi des coûts et de l'efficacité de la méthode d'isolement du composé actif. Compte tenu de ces exigences, le complexe Venetin-1 obtenu à partir du fluide cœlomique répond idéalement aux exigences d'un candidat à la recherche biomédicale. Dans d'autres analyses, nous avons l'intention d'explorer les effets du complexe sur diverses espèces de Candida, d'explorer la structure du complexe et d'analyser son action dans un organisme vivant dans un modèle murin.

En résumé, la préparation de vers de terre analysée avec un mécanisme d'action différent de celui d'un antibiotique typique incite à d'autres investigations, car elle semble être un composé antifongique prometteur.

Les données brutes utilisées et analysées au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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La recherche présentée a été soutenue par le projet du Centre national des sciences, Pologne [2020/37/B/NZ7/00763].

Département d'immunobiologie, Institut des sciences biologiques, Faculté de biologie et de biotechnologie, Université Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Pologne

Sylwia Wójcik-Mieszawska & Marta J. Fiołka

Département de biologie cellulaire, Institut des sciences biologiques, Faculté de biologie et de biotechnologie, Université Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Pologne

Kinga Lewtak

Laboratoire analytique, Institut des sciences chimiques, Faculté de chimie, Université Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Pologne

Weronika Sofińska-Chmiel

Département d'anatomie fonctionnelle et de cytobiologie, Institut des sciences biologiques, Faculté de biologie et de biotechnologie, Université Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Pologne

Jerzy Wydrytch

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SWM et MJF ont écrit le texte principal du manuscrit et préparé Venetin-1 pour la recherche ; SWM a préparé une cytométrie en flux et a préparé le tableau 1., Figs. 1, 2, 3 I, 6, 7, 9 ; MF préparé Figs. 3. Je, 4, 5 ; Analyse spectroscopique préparée par WSC et Fig. 10, Tableau 2; KL préparer Fig. 8; JW a effectué une analyse microscopique. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Marta J. Fiołka.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Wójcik-Mieszawska, S., Lewtak, K., Sofińska-Chmiel, W. et al. Changements atypiques dans les cellules de Candida albicans traitées avec le complexe Venetin-1 du liquide cœlomique de vers de terre. Sci Rep 13, 2844 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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Reçu : 21 novembre 2022

Accepté : 09 février 2023

Publié: 17 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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