L'ARN messager dans les nanoparticules lipidiques sauve les cellules HEK 293 des lipides

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 22293 (2022) Citer cet article

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Les outils analytiques pour étudier la physiologie cellulaire sont essentiels pour optimiser les interactions médicament-hôte. La spectroscopie RMN à chasse pulsée en temps réel, RTPC-NMR, a été introduite pour surveiller la cinétique de la production de métabolites dans les cellules HEK 293T traitées avec des nanoparticules lipidiques de type vaccin COVID-19, des LNP, avec et sans ARNm. Les paramètres de flux cinétique ont été résolus pour l'incorporation du marqueur isotopique dans les métabolites et la clairance des métabolites marqués des cellules. Les changements dans les temps caractéristiques de production d'alanine impliquaient un dysfonctionnement mitochondrial à la suite du traitement des cellules avec des nanoparticules lipidiques, les LNP. Le dysfonctionnement mitochondrial a été largement atténué par l'inclusion d'ARNm dans les LNP, dont la présence a augmenté la taille et l'uniformité des LNP. La méthodologie est applicable à toutes les cellules cultivées.

Le succès remarquable des vaccins à base de nanoparticules lipidiques d'ARNm modifiés par la pseudo-uridine, LNP, contre le COVID-19, qui exploite la machinerie translationnelle innée alimentée par le métabolisme cellulaire, propulse cette technologie à l'avant-garde de la médecine1,2,3,4,5,6 . De nombreuses applications potentielles des LNP d'ARNm pour traiter des maladies chroniques telles que le diabète7,8,9, les cancers et les troubles génétiques10,11 ont été testées. Les thérapies à base d'ARN messager utilisent un ensemble complexe de molécules biologiques qui doivent être optimisées pour chaque application. Ces cellules peuvent-elles supplanter les cellules environnantes pour les rares ressources nutritives des tissus vivants ? Combien de temps durera la production efficace de produits géniques d'ARNm? La dégradation des LNP des ARNm, qui libèrent de la méthyl pseudouridine, inhibera-t-elle la transcription ? Les lipides qui constituent les LNP vont-ils endommager le plasma et les membranes cellulaires internes ? Ces questions sont critiques et doivent être traitées pour faciliter la mise en œuvre thérapeutique.

La réponse dynamique des cellules aux traitements médicamenteux peut être évaluée par le profilage métabolique, qui est généralement réalisé en utilisant la spectroscopie de masse ou la spectroscopie RMN12,13. La méthodologie nécessite généralement une lyse et une extraction cellulaires pour détecter les concentrations totales de métabolites, fournissant des instantanés de la physiologie cellulaire sur une période d'heures à quelques jours qui est intrinsèquement biaisée en raison des processus en plusieurs étapes nécessaires pour préparer les échantillons12,13. La méthodologie invasive perturbe la structure compartimentée des réseaux métaboliques et peut ne pas refléter les processus réactifs qui se déroulent après l'absorption du vaccin à base de LNP. La spectroscopie RMN en temps réel utilise l'abondance naturelle de 13C ou des analyses basées sur des traceurs pour identifier les métabolites en collectant des spectres 1H édités par isotope 13C à partir de cellules, permettant une acquisition rapide des données, augmentant ainsi la résolution temporelle des expériences à 10 min ou moins14,15.

Des études métabolomiques plus récentes basées sur la RMN en temps réel utilisent un bioréacteur pour maintenir les cellules dans un état physiologiquement actif et peuvent détecter des métabolites intracellulaires libres, mais n'ont pas la capacité de surveiller les réactions clés telles que la glycolyse qui se déroulent en quelques minutes16,17,18 . L'introduction de la spectroscopie RMN à chasse pulsée en temps réel, RTPC-NMR, combine l'utilisation de la RMN du proton éditée au 13C-glucose et au 13C avec une cryosonde RMN ultrasensible19 et la conception améliorée d'un bioréacteur20 pour augmenter la résolution temporelle des expériences à 47 s permettant de suivre l'évolution rapide des flux métaboliques en réponse à des stimuli. Les métabolites marqués au 13C sont observés sur un fond non marqué. Cette méthode représente la pointe de la technologie pour analyser la santé cellulaire en capturant la dynamique de l'incorporation de carbone 13C de manière impartiale pour révéler comment les stimuli affectent les voies métaboliques.

L'ARNm de la luciférase modifiée contenant de la N1-méthylpseudouridine au lieu de l'uridine a été préparé par transcription in vitro sur la base d'un protocole publié précédemment et a été utilisé pour toutes les expériences. L'incorporation de N1-méthylpseudouridine augmente la stabilité de l'ARNm et améliore l'expression des protéines dans les cellules de mammifères22,23. Le transcrit purifié comprenait une queue poly(A) en 3' d'environ 150 nucléotides et Cap124 en 5' pour faciliter davantage la traduction des protéines (Figure 1 supplémentaire). L'ARNm modifié a été transfecté dans des cellules HEK 293T pendant 24 h à l'aide de cinq réactifs de transfection (Fig. 1a, tableau supplémentaire 1). Les cellules HEK 293T étaient auparavant utilisées pour surveiller l'absorption et l'expression de l'ARNm de la luciférase21,22. Conformément à Kariko et al.21,22, un seul réactif, Lipofectamine 2000, LF, a délivré suffisamment d'ARNm dans les cellules pour générer un signal de luminescence dépendant de la luciférase.

La lipofectamine augmente la stabilité de l'ARNm transfecté dans les cellules HEK 293T. (un). Les cellules ont été transfectées avec de l'ARNm de luciférase modifié pendant 24 h en utilisant cinq réactifs différents et l'activité de luminescence de la luciférase résultante a été quantifiée. Le contrôle ne contenait aucun ARNm et aucun réactif de transfection pour évaluer la luminescence de base. Les barres indiquent l'erreur relative. (b). Luminescence résultant de la transfection VECT avec l'ARNm de la luciférase modifiée nue (carrés) et de la transfection médiée par la LF avec l'ARNm de la luciférase modifiée (cercles). (c). Luminescence de cellules HEK 293T traitées avec LF-ARNm pendant différents temps. Les échantillons ont été traités en continu (ligne continue, cercles) ou pendant 8 h (ligne pointillée, carrés) ou 12 h (ligne pointillée, triangles).

L'échange de volume pour le transfert convectif, VECT, technique25,26 a été utilisé pour transfecter des cellules HEK 293T avec de l'ARNm nu. Malgré la base chimiquement modifiée, la production de protéines était limitée et le signal dépendant de la luciférase diminuait rapidement (Fig. 1b, tableau supplémentaire 2). La transfection médiée par LF du même ARNm a entraîné une expression soutenue de la protéine. Les données suggèrent que même les ARNm modifiés sont très instables et que l'utilisation de réactifs de transfection pour protéger l'ARNm de la dégradation est essentielle pour une expression soutenue des protéines.

Pour établir une fenêtre d'analyse pour les études métaboliques, l'étendue de l'expression des protéines a été examinée en incubant des cellules HEK 293 T avec des LNP d'ARNm LF à différents moments. Les échantillons traités en continu ou pendant 8 ou 12 h ont produit des quantités comparables d'activité dépendante de la luciférase au cours du même temps (Fig. 1c, tableau supplémentaire 3). L'expression maximale de la protéine a été observée à ~ 15 h pour les transfections continues et de 8 h, tandis que la transfection de 12 h présentait un pic d'expression à ~ 20 h. Toutes les transfections ultérieures ont été incubées pendant 10 h pour maximiser la production de protéines et pour la commodité expérimentale.

La stabilité et l'efficacité relatives des LNP sont fonction du diamètre et de la dispersité des particules, qui contrôlent l'efficacité de la biodistribution, la pénétration des tissus, le chargement et la libération de la cargaison et l'absorption cellulaire dans les tissus27,28,29. Pour les cellules cultivées, la taille de la LNP devrait jouer un rôle moindre dans la livraison de la cargaison en raison de l'absence de systèmes circulatoire et lymphatique qui minimisent la pénétration tissulaire en éliminant rapidement les particules plus petites. Les LNP forment des structures liposomales polydispersées avec des intérieurs aqueux stabilisés par une bicouche tensioactive ; le noyau aqueux fournit un environnement stable pour l'ARNm, réduisant la dégradation prématurée par rapport à l'ARNm nu30,31. Pour déterminer le rôle de l'ARNm dans l'interaction avec LF, les LNP ont été assemblés avec et sans ARNm, et colorés négativement avec de l'acétate d'uranyle pour l'imagerie au microscope électronique (Fig. 2). En l'absence d'ARNm, la distribution de taille des LNP était asymétrique avec une taille moyenne de particules de 29 ± 12 nm (Fig. 2a et c). L'inclusion de la cargaison d'ARNm dans les LNP LF a entraîné une population de tailles de particules plus grande et moins polydispersée avec une moyenne de 135 ± 12 nm (Fig. 2b et d) qui se situe dans la plage, 100-200 nm, de ceux utilisés avec succès pour administrer des médicaments anticancéreux à des tumeurs hautement perméables32.

La taille des nanoparticules lipidiques est stabilisée par l'ARNm. (a) Micrographie électronique de liposomes sans ARNm. ( b ) Micrographie électronique de liposomes contenant de l'ARNm de luciférase. ( c ) Distribution de taille des LNP sans ARNm. ( d ) Distribution de taille des LNP contenant l'ARNm de la luciférase. La courbe gaussienne a été tracée pour faciliter la visualisation comparative de la distribution.

La capacité de chasse aux impulsions a été ajoutée au bioréacteur en temps réel, RT, NMR décrit précédemment33. Le bioréacteur maintient des niveaux élevés de métabolites contenant du phosphate pendant > 24 h, ce qui correspond à une charge énergétique élevée et à des cellules métaboliquement actives33. Les cellules HEK 293T ont été conditionnées comme décrit précédemment dans de petites billes d'alginate d'environ 0, 6 mm de diamètre en utilisant un atomiseur20 et un Krebs-Henseleit modifié, KH, tampon34, un milieu sans sérum chimiquement défini35 classique utilisé pour étudier les cardiomyocytes. Les sels de tampon KH ont été additionnés de glucose, d'albumine de sérum bovin, de BSA, d'insuline et d'acide palmitique. La caractéristique critique du bioréacteur est une tige d'irrigation microporeuse (Fig. 3a) qui permet une distribution uniforme du milieu frais à travers des billes de cellules emballées33 dans un tube RMN de 5 mm et facilite l'échange rapide du milieu à partir du volume d'échantillonnage RMN d'environ 200 µL. Une impulsion de 15 ml de [U, 13C]-glucose uniformément marqué a été administrée via une boucle d'injection fixée en ligne avec le tube de distribution du milieu et contrôlée par un interrupteur mécanique (Fig. 3a). Pour éviter la formation de bulles d'air, le diamètre intérieur du tube a été adapté aux orifices des joints dans tout le dispositif. Le débit était contrôlé par une pompe péristaltique pour délivrer 100 à 200 uL/min. Les performances de l'appareil ont été optimisées pour introduire une impulsion de glucose marqué avec un temps de montée, ~ 10 min, plus rapide que le temps caractéristique de la glycolyse, 10-20 min36. À cette fin, la température expérimentale a été ajustée à 300 K pour ralentir le métabolisme cellulaire37. Les exécutions d'optimisation ont montré que 10 millions de cellules emballées dans des billes d'alginate et alimentées à l'aide d'une tige d'irrigation microporeuse sont capables de consommer environ 25 % du 13C-glucose administré au cours de l'expérience (Figure 2 supplémentaire).

Spectroscopie RMN pulse-chase en temps réel. (a) Bioréacteur utilisé pour la RMN RT-PC. Le bioréacteur modifié comprend une boucle injectable pour les expériences de poursuite d'impulsions ou une vanne pour les expériences de poursuite par étapes. ( b ) Cohérence quantique unique hétéronucléaire éditée 13C, HSQC 1H-13C, spectre RMN montrant les métabolites présents dans la cellule. Les encarts montrent la séparation des pics croisés des métabolites et les pics croisés du glycogène. La projection du HSQC 2D 1H-13C dans la dimension du proton est sur le haut du spectre. Le pic d'éthanol survient parce que l'éthanol a été utilisé pour solubiliser le supplément d'acide palmitique dans le tampon KH modifié. Les pics non marqués des métabolites, qui n'ont pas été utilisés pour l'analyse en raison d'un faible rapport signal sur bruit ou d'un chevauchement avec le tampon ou les pics de glucose après projection sur l'axe 1H, sont indiqués par un astérisque. ( c ) Impulsions de glucose 13C normalisées chassées avec du glucose non marqué dans des cellules HEK 293T non transfectées: (I) Avant l'impulsion, les cellules reçoivent du glucose non marqué dans un tampon KH modifié; (II) Au cours de l'étape d'incorporation, une impulsion de 15 mL de 13C-glucose est introduite à travers la boucle injectable ; (III) le 13C-glucose atteint une concentration plateau; (IV) Au cours de la phase de clairance, le 13C-glucose est éliminé du système. Au cours de toutes les étapes, les métabolites individuels sont surveillés à mesure qu'ils progressent dans les voies métaboliques. Les traces rouges et noires représentent des échantillons biologiques répliqués. ( d ) Temps de montée et de descente pour les fronts d'attaque et de fuite, tRG et tFG, des impulsions indiquées dans le panneau c.

Le niveau d'ATP des cellules a été contrôlé avant et après chaque expérience en recueillant un spectre RMN du phosphore. Les cellules vivantes maintiennent des niveaux homéostatiques d'ATP qui peuvent être facilement discernés dans un spectre 1D. Les résultats n'ont montré aucune réduction des niveaux d'ATP au cours de chaque expérience (Figure 3 supplémentaire). Le pH intracellulaire a été estimé entre 7,2 et 7,5 sur la base de la différence entre les pics de phosphocréatine, PCr et de phosphate inorganique, Pi, à - 3,18 ppm et 2,13 ppm, respectivement38,39. L'oxygénation a été évaluée par le rapport PCr/ATP et s'est avérée être d'environ 0,6, ce qui se situe dans la plage normalement observée pour les reins de rat perfusés (Figure 3 supplémentaire)40. Ce rapport n'a pas changé au cours de l'expérience et a montré que malgré un emballage dense dans des billes d'alginate, les cellules n'étaient pas hypoxiques41,42.

Des expériences unidimensionnelles de RMN du proton éditées au 13C43 ont été utilisées pour surveiller le carbone métabolisé à partir du glucose marqué isotopiquement43. Étant donné que les signaux de protons provenant des métabolites se chevauchent, une cohérence quantique unique hétéronucléaire bidimensionnelle éditée au 13C, HSQC43, spectre RMN a d'abord été acquise pour identifier les métabolites présents dans le spectre de protons (Fig. 3b). Seuls les pics de Hγ – Cγ du glutamate, Hβ – Cβ de l'alanine et Hγ – Cγ du lactate ne se chevauchaient pas après projection à la dimension du proton (Fig. 3b). Les scissions observées dans la dimension carbone ont montré que le lactate, l'alanine et le glutamate étaient des produits de la glycolyse et d'un seul cycle de TCA (Fig. 3b encarts)44. En raison de l'alimentation continue en glucose, aucune contribution significative de la gluconéogenèse n'était attendue. Les pics non chevauchants correspondant au lactate, à l'alanine et au glutamate étaient d'une force suffisante pour réduire le temps d'acquisition à 47 s, ce qui était la résolution temporelle des expériences.

Un profil d'impulsion pour le 13C-glucose dans des cellules HEK 293T non traitées est illustré à la Fig. 3c. Il y a eu une augmentation rapide du signal lorsque le glucose marqué isotopiquement est entré dans le tube RMN. Le signal a atteint une concentration de plateau et a diminué lorsque le 13C-glucose a été chassé par du glucose non marqué. La non-idéalité des fronts d'attaque et de fuite de l'impulsion de glucose est décrite par les temps de montée et de descente, tRG et tFG, respectivement, qui ont été résolus en ajustant le profil d'impulsion-chasse à une association/décroissance exponentielle à une seule phase (Figure supplémentaire 4 et tableau supplémentaire 4). Des taux différentiels de diffusion surviennent lorsque l'impulsion entre et sort du système, ce qui entraîne des temps de chute nettement plus longs (Figure 5 supplémentaire). Ces différences sont en partie le résultat de la variation de la densité de remplissage des cellules associée à chaque échantillon physique.

Les cellules HEK 293T ont été cultivées dans OptiMEM sur des plaques et laissées non traitées (contrôle) ou traitées pendant la nuit avec LF ou LF-ARNm. Les devenirs du lactate, de l'alanine et du glutamate ont été surveillés au fur et à mesure que le glucose marqué était métabolisé (Fig. 4). Chaque expérience a duré environ 6 h et a été répétée au moins deux fois en utilisant des répétitions biologiques. Contrairement au glucose marqué, les intensités maximales des pics croisés des métabolites variaient d'un facteur deux entre les expériences individuelles tandis que le profil temporel restait inchangé. La variation de la concentration absolue de métabolites avec chaque préparation cellulaire reflète l'hétérogénéité inhérente (clonale) des cellules vivantes présentes même sans changement de croissance et n'est pas inattendue pour les échantillons biologiques répliqués45,46. Les intensités des pics croisés des métabolites augmentaient lorsque les métabolites marqués pénétraient dans le pool libre après la biosynthèse et diminuaient lorsqu'ils étaient liés ou incorporés de manière transitoire dans des biomolécules plus grandes, ou éliminés du pool libre lorsque le glucose marqué était retiré du système.

Profils de flux cinétiques à l'échelle des métabolites dans les cellules HEK 293T. ( a ) Illustration montrant la disposition métabolique du 13C-glucose observée lors d'une expérience RTPC-NMR. ( b ) Profils de flux cinétiques des métabolites résultant d'une impulsion de 15 ml de 13C-glucose dans des cellules HEK 293T et d'une alimentation continue de 13C-glucose dans des cellules HEK 293T traitées pendant 10 h avec LF. Les traces rouges et noires représentent des échantillons biologiques répliqués.

Dans des conditions de flux de nutriments uniformes, le bord avant/arrière des profils de chasse aux impulsions a présenté des augmentations/diminutions exponentielles de la concentration de métabolite libre. Pour estimer les paramètres cinétiques pour la production de métabolites marqués individuels, les KFP de deux expériences ont été mis à l'échelle et les bords d'attaque ajustés à une exponentielle à deux phases qui prend en compte la forme réelle de l'impulsion de 13C-glucose :

où y est la concentration relative du métabolite libre, tP est le temps de production nécessaire pour que les signaux du métabolite atteignent ~ 63 % de saturation, yPo est la concentration relative lorsque le signal commence à augmenter, et ARo et AP sont des constantes. Pour estimer les paramètres cinétiques de la clairance des métabolites marqués du pool libre, les bords de fuite des profils ont également été ajustés à une exponentielle à deux phases :

où tC est le temps de clairance pour une réduction de 63 % des signaux de métabolites, yCo est la concentration relative lorsque le signal commence à diminuer, et AFo et AC sont des constantes. Le premier terme des Eqs. (1) et (2) prennent en compte la non-idéalité des impulsions de 13C-glucose due à la diffusion (Fig. 3c et d et Tableau supplémentaire 4) lorsque tRG et tFG ne sont pas beaucoup plus courts que tP et tC des métabolites.

Les cellules HEK 293T témoins qui n'ont pas subi de traitement LF ou LF-ARNm présentaient des profils de bord avant et arrière bien définis pour le lactate, l'alanine et le glutamate (Fig. 4). Les niveaux de lactate ont atteint un état d'équilibre isotopique47 qui a persisté jusqu'à ce que le glucose marqué soit chassé. L'alanine a présenté une petite baisse constante des niveaux de plateau dans des conditions de contrôle. Le profil pour le glutamate a atteint un maximum à peu près au moment où l'impulsion de glucose marquée a été chassée du système.

Les constantes de temps moyennes résolues pour la production, tP, et la clairance, tC, étaient respectivement de 14 et 26 min pour le lactate et de 13 et 30 min pour l'alanine (tableau supplémentaire 5 et figures supplémentaires 6 et 7), ce qui correspond au fait que le lactate, qui est dérivé du pyruvate, et l'alanine sont des produits de la glycolyse, qui est la voie métabolique la plus rapide et se produit dans le cytosol (Fig. 4). Le glutamate, qui est synthétisé dans les mitochondries à partir de l'α-cétoglutarate au cours du cycle TCA, a présenté les temps moyens les plus lents, 75 et 60 min pour la production et la clairance, en raison de sa dépendance aux produits de la glycolyse et de la lenteur de l'importation et de l'exportation des métabolites vers et depuis mitochondries (tableau supplémentaire 5 et figure supplémentaire 8).

Les profils de flux cinétiques de lactate et d'alanine dans les cellules traitées avec LF ou LF-ARNm étaient qualitativement similaires aux témoins (Fig. 4) présentant des augmentations faibles mais significatives de tC par rapport à tP (tableau supplémentaire 5) en raison de la fraction liée de métabolite marqué ou leurs précurseurs (tableau complémentaire 5, figure 5a). Le temps de clairance constamment plus lent pour le lactate et l'alanine reflète une augmentation de la concentration de métabolites marqués libres lorsqu'ils sont échangés hors de la fraction liée et sont utilisés pour le métabolisme en cours. Les différences entre tP et tC pour le glutamate n'étaient pas significatives (tableau supplémentaire 5, figure 5a), très probablement parce que la concentration intracellulaire libre de glutamate est généralement environ 20 fois supérieure à celle du lactate ou de l'alanine48, de sorte que le glutamate marqué lié ne modifie pas substantiellement le concentration libre. L'écart le plus notable a été observé pour l'alanine dans les cellules exposées à la LF (Fig. 4) pour laquelle le plateau d'état d'équilibre isotopique observé dans les cellules témoins a été remplacé par une diminution monotone de l'intensité du signal suivie d'une diminution exponentielle rapide lorsque l'impulsion de glucose marquée était supprimé. Les niveaux d'alanine à l'état d'équilibre isotopique ont été restaurés lorsque les cellules ont été traitées avec LF-ARNm.

Évaluation statistique des différences entre les paramètres KFP (a) temps de production et de dédouanement, tP et tC ; (b) les temps caractéristiques, tch = 2/(1/tP + 1/tC), (c) les paramètres de liaison, K = (1/tP—1/tC)/2, pour chaque métabolite, et (d) les pentes des KFP d'alanine après traitement avec LF et LF-ARNm. Les points représentent les points de données obtenus à l'aide d'échantillons biologiques répliqués. Les étoiles indiquent la signification : p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) et p < 0,001 (***).

Il convient de noter que le lactate a également été détecté dans le flux du bioréacteur et est donc excrété par les cellules (Figure 2 supplémentaire) mais le taux d'excrétion, ~ 1/20 min−1, qui est le taux de production de lactate (Tableau 1) , est beaucoup plus lent que le débit de nutriment de 200 μL/min divisé par le volume d'échantillonnage RMN de 200 μL (1 min−1). En conséquence, on observe principalement du lactate marqué intracellulaire. Les temps de production de lactate et d'alanine, tP, étaient significativement plus lents dans les cellules HEK 293 T traitées par LF-ARNm par rapport au témoin (Fig. 5a; Tableau supplémentaire 5). Les profils de glutamate présentaient une erreur expérimentale systématiquement plus élevée dans les cellules traitées avec LF ou LF-ARNm. Cela pourrait être le résultat du bruit d'échantillonnage inhérent aux répliques biologiques ou une indication d'activité mitochondriale aberrante ou les deux.

L'incorporation isotopique à l'état d'équilibre des métabolites dans la fraction liée et l'accumulation de métabolites libres dans toutes les conditions peuvent être expliquées par un modèle simple de compétition pour les sites de liaison (voir les équations (14) et (15)). Le modèle prédit que la compétition entre les métabolites marqués et non marqués pour les sites de liaison raccourcira tP et allongera tC (Eqs. 11 et 13, Tableau supplémentaire 5, Figure supplémentaire 9). Dans ce modèle, le temps caractéristique du flux de métabolites, tch, est égal à la moyenne harmonique entre tP et tC et le paramètre de liaison caractéristique qui décrit le temps d'incorporation du glucose marqué dans et de libération de la fraction liée, K, est égal à la moitié de la différence entre 1/tP et 1/tC et équivaut au taux de fois la concentration des sites de liaison (tableau 1).

Aucune différence significative dans le tch n'a été résolue pour le métabolisme du lactate et du glutamate après un traitement avec LF ou LF-ARNm ou pour l'alanine traitée avec LF (tableau 1, figure 5), indiquant que les flux métaboliques glycolytiques et mitochondriaux n'étaient pas perturbés. Il y avait une augmentation significative du tch pour le métabolisme de l'alanine en présence d'ARNm LF par rapport aux cellules témoins (Fig. 5b). L'augmentation indique une modification du métabolisme de l'alanine dans les cellules traitées avec LF-ARNm, ce qui pourrait entraîner une augmentation du temps d'utilisation du pool libre d'alanine entraînant une fraction liée plus élevée et/ou une diminution de la production d'alanine. Cependant, les valeurs de K résolues pour chaque métabolite n'étaient pas significativement différentes, ce qui implique que la distribution métabolique des métabolites liés et libres n'était pas affectée par la présence de LF ou d'ARNm de LF (Fig. 5c; Tableau 1). Les valeurs négatives résolues pour le glutamate résultaient de la grande erreur associée à ces mesures.

Pour étudier plus avant les perturbations associées au métabolisme de l'alanine, une fonction échelonnée du glucose marqué a été appliquée aux cellules traitées avec LF pendant 10 h (Fig. 4). La boucle d'injection a été remplacée par une vanne qui basculait le débit d'entrée vers un réservoir contenant du milieu 13C-glucose. Le lactate et le glutamate ont affiché un comportement isotopique à l'état d'équilibre, mais le profil de l'alanine a atteint une valeur maximale et a diminué de manière monotone au cours de l'expérience, qui a duré environ deux fois plus longtemps que les expériences d'impulsion. La diminution de l'intensité du signal de plateau pour l'alanine a été analysée en ajustant les profils de plateau d'alanine à une fonction linéaire (tableau supplémentaire 6; figure 5d). La valeur moyenne de la pente résolue pour les cellules traitées avec LF, 0,005 min-1, était 2,5 fois supérieure à celle du contrôle et, de manière significative, 5 fois supérieure à celle des cellules traitées avec LF-ARNm (tableau supplémentaire 6) indiquant un processus très lent (Fig. 5d). Étant donné que la distribution de l'alanine liée et libre n'a pas été perturbée et que la petite quantité d'alanine excrétée est restée constante au cours de l'expérience (Figure 10 supplémentaire), la pente du plateau de l'alanine reflète très probablement une diminution de la biosynthèse de l'alanine. L'essentiel de la synthèse de l'alanine repose sur la disponibilité du glutamate, qui est dérivé de l'α-cétoglutarate, un produit du cycle TCA dans les mitochondries, dans la biosynthèse de l'alanine par amidation du pyruvate et peut indiquer un transport déficient du glutamate hors des mitochondries (Fig. .4a). Il est également possible que les niveaux d'alanine soient influencés par le recâblage du métabolisme de la glutamine dans les mitochondries défectueuses49 et, si les mitochondries sont compromises par la génération d'espèces réactives de l'oxygène, les ROS, la production de glutamate peut également être compromise. L'une ou l'autre condition pourrait conduire à une réduction du temps de biosynthèse de l'alanine.

Une perturbation de la fonction mitochondriale, une dépolarisation membranaire et une défaillance du transport des électrons ont été observées dans les cellules progénitrices neuronales traitées avec la lipofectamine50. La fuite d'électrons du système de transport d'électrons sur la membrane interne entraîne une réduction partielle de l'oxygène pour former du superoxyde, un ROS, qui peut finalement entraîner une mitophagie. Pour examiner si la fonction mitochondriale peut être affectée par la FL, les cellules HEK 293T ont été traitées avec MitoSOX, qui devient fluorescente lorsqu'elle est oxydée par les ROS mitochondriales, imagées (Fig. 6a) et dosées (Fig. 6b).

Production de ROS dans les cellules HEK 293T en réponse à l'exposition au LNP avec et sans ARNm. ( a ) Les cellules colorées MitoSOX révèlent la présence de ROS (colorées en rouge). La coloration Deep Red FM (colorée en vert) montre des mitochondries intactes. Les panneaux de superposition indiquent que les ROS proviennent des mitochondries. ( b ) Quantification de la fluorescence MitoSOX dans les cellules. Les points représentent les points de données obtenus à l'aide d'échantillons techniques répétés. Les barres d'erreur représentent l'écart moyen. Les étoiles indiquent la signification : p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) et p < 0,001 (***).

Le traitement des cellules avec un contrôle positif pour les ROS, l'antimycine A, qui se lie au site actif Qi de la cytochrome c réductase et inhibe la respiration cellulaire, a entraîné une augmentation significative des ROS mitochondriales par rapport aux cellules non traitées (Fig. 6b)51. Les cellules traitées avec LF et incubées pendant 4 h présentaient des niveaux significativement plus élevés de ROS par rapport aux cellules non traitées, et cette différence augmentait avec des incubations plus longues, 28 h. L'inclusion d'ARNm dans le LNP a conduit à des niveaux significativement plus faibles de ROS par rapport à LF seul, similaires aux cellules non traitées après une incubation de 4 h (Fig. 6b) et a restauré le plateau isotopique à l'état d'équilibre pour l'alanine dans la métabolomique RTPC-NMR dans la cellule. expériences (fig. 4). La coloration des mitochondries intactes et de l'ADNdb n'a indiqué aucune différence dans les réactions mitophagiques ou autophagiques (Fig. 6a). Ainsi, la diminution apparente de la biosynthèse de l'alanine peut être due à un dysfonctionnement mitochondrial induit par la LF, donnant lieu à des ROS.

À mesure que les vaccins à ARNm médiés par les LNP deviennent plus largement disponibles en tant que traitement thérapeutique, la compréhension de l'effet des LNP sur les cellules et les tissus devient plus importante5. Les ARN messagers seuls sont trop instables pour être utilisés comme agents de transfection, même ceux contenant des bases modifiées. L'ARNm doit être protégé par des LNP spécifiques pour être utilisé efficacement par la cellule. Mais les LNP sont toxiques50. La partie lipidique de l'analogue du vaccin semblait provoquer un dysfonctionnement de la membrane mitochondriale sous la forme d'une augmentation des ROS, dont les effets ont été atténués par l'inclusion d'ARNm dans les LNP. Les cellules HEK 293T traitées avec des LNP contenant de l'ARNm ont pu accéder aux nutriments et produire des protéines pendant plus de 24 h, ce qui implique que la libération inévitable de pseudouridine lors de la dégradation de l'ARNm n'a pas inhibé la transcription du produit d'ARNm. La technique est sensible aux métabolites libres mais contient des informations sur le pool de métabolites liés de manière covalente, comme dans le glycogène52, ou de manière non covalente, comme dans les interactions protéine-ligand53. L'utilisation de la métabolomique intracellulaire en tant que technologie émergente pour évaluer les effets néfastes des PNL peut aider à optimiser leur efficacité et à traiter d'éventuels effets hors cible54.

La plupart des méthodologies métaboliques fournissent un instantané de la physiologie cellulaire qui modifie la distribution entre les métabolites libres et liés en perturbant la partition intracellulaire et en diluant le pool métabolique36. La RMN de chasse d'impulsions en temps réel évite ces complications en introduisant une impulsion de 13C-glucose marqué isotopiquement dans les cellules d'un bioréacteur et en surveillant directement les temps d'incorporation et de clairance des métabolites marqués à l'intérieur des cellules vivantes. En utilisant des séquences d'impulsions RMN protoniques éditées au 13C unidimensionnelles, seuls les composés marqués sont observés. La force du signal RMN augmente lorsque le 13C-glucose est introduit à mesure que des niveaux intracellulaires de métabolites marqués libres sont générés et diminue à mesure qu'ils sont incorporés dans le métabolisme intermédiaire, liés de manière transitoire ou éliminés du système lorsque l'impulsion est supprimée. Le court temps d'acquisition spectrale offre une résolution temporelle de 47 s, suffisamment rapide pour observer le début de processus rapides tels que la glycolyse.

La spectroscopie RTPC-RMN s'est avérée efficace pour surveiller l'activité des voies de production d'énergie dans les cellules HEK 293T dans des conditions de flux de nutriments à l'état d'équilibre isotopique en réponse à un analogue de vaccin ARNm-LNP et pour identifier les changements dans les flux métaboliques dus à l'introduction de composés thérapeutiques. Trois espèces étaient bien résolues dans les spectres RMN du proton 13C édités, le lactate, l'alanine et le glutamate; ce sont parmi les métabolites les plus abondants à l'intérieur d'une cellule48. L'accumulation de métabolites a suivi une progression bien connue des voies métaboliques qui participent à l'extraction de l'énergie cellulaire. Les profils cinétiques générés pour chacun ont été analysés en utilisant une cinétique de premier ordre pour produire des constantes de temps, tP et tC, pour la production et la clairance des métabolites marqués des cellules respectivement. Les paramètres dérivés expérimentalement ont résolu les temps caractéristiques des flux métaboliques, tch, ainsi que la contribution de la fraction liée des métabolites au flux, K. Le lactate et l'alanine ont été produits le plus rapidement par la glycolyse, qui a lieu dans le cytosol et répond immédiatement à la présence de glucose. La synthèse du glutamate dans les mitochondries, qui repose sur les produits de la glycolyse et le cycle du TCA, s'est produite plus lentement (tableau 1).

L'accumulation rapide de lactate et d'alanine observée dans des conditions de contrôle n'était généralement pas perturbée par l'ajout de LNP avec ou sans ARNm. Des temps de clairance systématiquement plus lents résultaient de l'incorporation de métabolites marqués libres ou de leurs précurseurs dans la fraction liée, qui était lentement libérée lorsque l'impulsion était chassée des cellules. L'augmentation significative du temps caractéristique de l'alanine dans les cellules traitées avec l'ARNm LF est indicative de la charge métabolique décrite précédemment de la production de protéines recombinantes qui entraîne une croissance cellulaire plus lente55 et une diminution de la glycolyse aérobie56,57. Des changements distincts dans le profil de plateau pour la clairance de l'alanine impliquaient un dysfonctionnement mitochondrial dans l'exportation de glutamate à la suite du traitement des cellules avec des LNP seuls tandis que la production de glutamate via le cycle TCA restait inchangée. Ce postulat était étayé par la présence de ROS dans les cellules traitées avec des LNP. L'étendue des ROS a été considérablement réduite et le comportement de contrôle a été largement restauré en incluant l'ARNm dans les LNP. Les résultats suggèrent que l'alanine peut fonctionner comme une sonde sensible pour la toxicité induite par le LNP.

L'incorporation d'ARNm dans les LNP s'est avérée nécessaire pour une expression génique forte. L'encapsulation de l'ARNm a augmenté la taille moyenne des LNP de 29 à 135 nm et a entraîné une dispersité plus symétrique, paramètres critiques pour la stabilité et l'efficacité. Dans ce travail, le protocole du fabricant a été utilisé pour préparer les LNP avec et sans ARNm. Aucune tentative n'a été faite pour faire varier la distribution de taille des particules résultantes.

Les LNP internalisés diffusent à travers le milieu cellulaire à une vitesse inversement proportionnelle à leur taille. Nous supposons que la diffusion rapide de plus petits LNP couplée à la stabilité accrue offerte par l'absence d'interactions lipide-ARN58 se traduira par des LNP à longue durée de vie et pénétrant plus profondément où ils peuvent interagir avec et endommager les structures membranaires internes, y compris les mitochondries. Cela peut expliquer comment les LNP vides suscitent une plus grande production de ROS que ceux qui sont chargés de cargaison et, en combinaison avec l'exigence d'une exportation mitochondriale appropriée du glutamate dans la biosynthèse primaire de l'alanine, pourquoi seuls les profils d'alanine différaient en l'absence et la présence d'ARNm .

Des cellules rénales embryonnaires humaines, HEK293T, ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection et cultivées selon les conditions recommandées. Le Nl-méthylpseudouridine-triphosphate a été acheté auprès de TriLink Biotechnologies. Les réactifs de transfection Fugene 6, Fugene HD, ViaFect et le kit Luciferase Assay System ont été obtenus auprès de Promega. La PEI linéaire (25 kDa) a été achetée chez Polysciences, la roténone chez MP Biomedicals et l'Antimycine A chez Sigma-Aldrich. Lipofectamine 2000, LF, milieu Eagle modifié de Dulbecco, DMEM, milieu de sérum réduit Opti-MEM, solution saline tamponnée au phosphate, PBS et MitoSOX provenaient de ThermoFisher Scientific. Le plasmide pTK305 utilisé pour la transcription in vitro de l'ARNm de la luciférase de luciole a été acheté chez Addgene (plasmide n° 66 812 ; http://n2t.net/addgene : 66812 ; RRID : Addgene_66812).

Le plasmide pTK305 a été amplifié et linéarisé avec l'enzyme de restriction Ascl (New England Biolabs), extrait avec du phénol/chloroforme et précipité avec de l'éthanol/acétate d'ammonium. L'ADN linéarisé a été redissous dans du tampon Tris-EDTA, TE, sans ARNase à une concentration de 1 mg/mL et a servi de matrice pour la transcription in vitro à l'aide du kit de transcription MEGAscript T7 (Ambion) avec des nucléotides non modifiés ou avec N1- le méthylpseudouridine-triphosphate remplaçant l'uridine-triphosphate dans la réaction. La synthèse d'ARNm a été réalisée selon le protocole du fabricant. L'ARNm résultant a été purifié par précipitation avec du chlorure de lithium 7, 5 M, EDTA 50 mM, LiCl / EDTA, pendant ≥ 30 min à - 20 ° C. Le culot a été dissous dans de l'eau sans ARNase.

Pour introduire la structure Cap1 à l'extrémité 5', l'ARNm a été dénaturé à 65 °C pendant 10 min et le système de coiffage Cap1 ScriptCap™ (Cellscript) a été utilisé conformément aux directives du fabricant. La réaction a été terminée en ajoutant un demi-volume de solution de LiCl/EDTA et redissoute dans de l'eau sans ARNase. Pour ajouter une queue poly(A) en 3', l'ARNm a de nouveau été dénaturé à 65 °C pendant 10 min et le kit A-Plus™ Poly(A) Polymerase Tailing (Cellscript) a été utilisé conformément aux directives du fabricant. La réaction a été incubée à 37 ° C pendant 2 h et terminée en ajoutant de l'EDTA à 15 mM. L'ARNm a été purifié en ajoutant un volume égal d'acétate d'ammonium 5 M, en incubant sur de la glace et en centrifugeant le précipité. L'ARNm de N1-méthylpseudouridine polyadénylé et coiffé résultant a été dissous dans de l'eau sans ARNase à une concentration de 1 mg / ml, aliquoté et stocké à - 70 ° C.

Les cellules HEK 293T ont été cultivées dans un milieu complet, milieu d'Eagle modifié de Dulbecco, DMEM additionné de 4 mM de L-glutamine, 5,5 mM de D-glucose, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 % de sérum bovin fœtal (HyClone), 100 unités/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine. Pour déterminer l'efficacité de la transfection, les cellules ont été transfectées avec cinq réactifs différents dans une plaque à 24 puits, 2 puits pour chaque transfection. Chaque puits a été ensemencé avec 5 × 104 cellules dans 0,5 mL de DMEM/10 % FBS 24 h avant la transfection et incubé dans une chambre de croissance dans 5 % de CO2 à 37 °C. Le milieu de croissance a été remplacé par Opti-MEM/5 % FBS et 0,5 µg d'ARNm de luciférase ont été combinés avec 1,5 µL de FuGENE 6, 1,5 µL de FuGENE HD, 2 µL de ViaFect ou 1 µL de LF dans Opti-MEM et incubés à température ambiante selon les recommandations du fabricant. 2,5 µL de 1 mg/mL de polyéthylèneimine linéaire, PEI, ont été combinés avec 0,5 µg d'ARNm de luciférase dans 47 µL d'Opti-MEM et incubés pendant 20 min à température ambiante. Des cellules HEK 293T non traitées ont été utilisées comme témoin autoluminescent. Les mélanges de transfection ont été transférés dans des plaques à puits et incubés pendant 24 h dans une chambre de croissance. Les cellules ont été lavées avec du PBS et lysées en ajoutant 50 µL de réactif de lyse de culture cellulaire luciférase 1X (Promega). Les cellules ont été grattées et le contenu des puits a été centrifugé à 16 000 g pendant 5 min. Les surnageants ont été transférés dans de nouveaux tubes et conservés à - 70 °C. Pour doser l'activité de la luciférase, 20 µL de lysat ont été mélangés avec 100 µL de réactif de dosage de la luciférase (Promega) dans une plaque blanche à 96 puits (Greiner Bio-One) et lus immédiatement sur un lecteur de plaque hybride multimode Synergy H1 (BioTek Instruments) . Notez que le réactif LF utilisé dans ces expériences est composé d'un mélange de polycationiques et de phospholipides. La formation de LNP contenant une cargaison d'acide nucléique résulte d'interactions électrostatiques entre le squelette phosphate du polymère d'acide nucléique et les lipides chargés positivement59.

Pour les expériences dans le temps, les cellules transfectées ont été cultivées sur des plaques de 10 cm jusqu'à une confluence de 60 à 80 % et récoltées avec 0, 25 % de trypsine-EDTA (Gibco) pendant 5 à 10 min à 37 ° C. La trypsine a été neutralisée en utilisant une dilution au quintuple avec du milieu complet, les cellules ont été comptées et culottées par centrifugation à 200 g pendant 10 min. Les cellules ont été remises en suspension dans Opti-MEM/5 % FBS à une concentration de 0,6–1 × 106 cellules/mL et aliquotées dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL à raison de 0,5 mL par tube. Les tubes ont été incubés dans la chambre de culture en position inclinée avec les couvercles ouverts. Pour chaque transfection, 2 µL de LF ont été mélangés avec 23 µL d'Opti-MEM et incubés pendant 5 min à 37 °C. Un µg d'ARNm dans 25 µL d'Opti-MEM a été ajouté et l'incubation s'est poursuivie pendant 20 min. Les mélanges de transfection ont été ajoutés aux cellules et les tubes ont été placés dans la chambre de croissance. Aux moments appropriés, les cellules ont été centrifugées à 200 g pendant 5 min, lavées avec du PBS et lysées comme décrit ci-dessus pour le test de luminescence. Pour certaines expériences, le milieu a été retiré après 8 ou 12 h de transfection et remplacé par du DMEM pour une incubation supplémentaire. Lorsque la microfluidique a été utilisée pour la livraison d'ARNm (ci-dessous), les cellules traitées ont été remises en suspension dans Opti-MEM/5 % de FBS, placées dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL à 0,5 mL par tube, incubées dans la chambre de croissance pendant des durées spécifiées, centrifugées et lysées comme au-dessus de.

Les cellules pour les expériences de RMN ont été cultivées sur des plaques de 15 cm dans 20 mL de DMEM/FBS à 10 % jusqu'à une confluence de 60 à 80 %. Les mélanges de transfection ont été multipliés par 100, c'est-à-dire 200 µL de LF dans 2,5 mL d'Opti-MEM avec ou sans 100 µg d'ARNm. Après une incubation de 20 min, des mélanges de transfection ont été ajoutés aux plaques et les transfections ont pu se dérouler dans la chambre de croissance à 37 ° C, 5 % de CO2, pendant 10 à 11 h.

Trois boîtes de culture de 15 cm (Corning) contenant du milieu de culture ont été ensemencées avec 4 × 106 cellules HEK 293T et incubées dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 48 à 72 h jusqu'à ~ 80 % de confluence (~ 1,2 × 107 cellules/plaque). Les cellules ont été récoltées comme décrit ci-dessus60, passées à travers un filtre de 40 µm pour réduire l'agglutination et l'agrégation, et comptées. ~ 3 × 107 cellules ont été mises en suspension dans un tampon de flux cellulaire, 0,4 % de BSA, 0,04 % d'EDTA, 20 % de Percoll et 5 µL de Tween-20 auquel l'ARNm de Luciférase de luciole modifié dans le tampon de stockage a été ajouté à une concentration finale de 300 µM et finale volume de 3 ml. Un polydiméthylsiloxane à deux canaux, PDMS, Volume Exchange for Convective Transfer, VECT, dispositif avec des microcanaux rigides de 9,6 µm a été préparé comme décrit précédemment61,62. L'appareil a été purgé pour éliminer l'air et les débris à l'aide d'un tampon de passivation, 1 % de BSA dans du PBS, et placé sur la platine d'un microscope Vista Vision (VWR) pour la surveillance du cycle en cas de bulles ou de blocages. La suspension cellulaire a été passée à travers le dispositif VECT à l'aide d'une pompe à seringue New Era Pump Systems modèle 300 à un débit de 100 ul/min. Le flux résultant a été collecté et équilibré pendant 20 min à température ambiante pour maximiser la transfection et faciliter la récupération des cellules. Les cellules ont été centrifugées à 200 g pendant 6 min à 25 ° C et lavées deux fois avec 5 ml de PBS pour la spectroscopie RMN in-cell.

Des grilles de microscopie en cuivre revêtues de carbone (300 mesh, Electron Microscopy Sciences) ont été luminescentes en utilisant de l'air dans un nettoyeur à plasma Harrick pendant 30 s. Des liposomes et des complexes liposome-ARNm ont été appliqués sur la grille fraîchement déchargée dans des gouttelettes de 5 µL et laissés à adsorber pendant 5 min dans un plat de tissu fermé de 15 cm pour minimiser l'exposition à l'air et le séchage excessif. La solution d'échantillon a été réappliquée quatre fois. De l'acétate d'uranyle à 2 % (p/v) a été préparé et mélangé pendant une nuit dans une pièce sombre sur un nutator à plate-forme. La grille a été colorée à l'aide de 5 µL d'acétate d'uranyle à 2 % pendant 1 min déposés directement sur la grille et lavés 3 fois avec 5 µL d'eau distillée ultra-pure. L'excès de solution a été éliminé par buvardage avec du papier Whatman entre chaque étape63.

Les micrographies ont été capturées à l'aide d'un microscope électronique à transmission JEOL JEM-1400, TEM, utilisant une puissance de 80 kV et un dispositif à couplage de charge XR401, CCD, caméra (AMT Imaging). Les images ont été capturées avec un temps d'exposition de 780 ms à des grossissements de 30 000, 40 000 et 80 000. Un total de 17 images contenant 1094 particules ont été traitées à seuil bas, moyen et haut à l'aide du programme Fiji (logiciel ImageJ). Les surfaces de particules individuelles ont été mesurées à l'aide de la fonction Analyser les particules. Toutes les particules ont été automatiquement sélectionnées et ont été filtrées manuellement pour omettre les valeurs aberrantes telles que les particules directement sur la bordure des images ou plusieurs particules qui se chevauchaient.

~ 10 × 107 cellules (~ 500 µL) ont été mélangées 1:1 (v/v) avec Krebs–Henseleit, KH, sels, HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 118 mM, KCl 4,7 mM, CaCl2 2,5 mM, 1,2 mM MgCl2 et NaH2PO4 3 mM contenant 2 % d'alginate (Sigma). Le mélange a été transféré dans une seringue de 3 ml et équipé d'un embout Luer-lock connecté à 40 mm de tube Tygon (ID 0,79 mm) avec une aiguille émoussée de calibre 21. L'aiguille était orientée à 45° par rapport à la surface d'un bécher de 25 ml contenant 150 mM de CaCl2. Les cellules ont été injectées dans un atomiseur à 300 µL/min à l'aide d'une pompe à seringue (New Era Pump System NE-300). L'atomiseur consistait en une pipette orientée verticalement avec un débit d'air de 5,5 L/min. Le contact avec la solution de CaCl2 a provoqué la polymérisation de l'alginate en billes de taille uniforme qui encapsulaient les cellules. La solution de CaCl2 a été décantée et remplacée par 25 ml de sels de KH additionnés de glucose 5 mM, de palmitate 0,4 mM, de BSA 0,4 mM et de 70 mU/L d'insuline. Les billes ont ensuite été transférées dans le bioréacteur.

Le bioréacteur utilisé pour collecter les données métaboliques était presque identique à celui décrit précédemment20, comme le montre la figure 3a. L'injecteur (Rheodyne) a été connecté à la ligne d'entrée à 120 cm d'un réservoir chauffé contenant des sels de KH frais additionnés de 5 mM de 12C-glucose et équipé d'une boucle d'injection de 15 ml construite à partir d'un tube en polyéthylène (1,19 mm ID, Clay Adams). La boucle contenait des sels de KH additionnés de 5 mM de 13C-glucose, permettant une transition ininterrompue vers le milieu marqué. Une fois les billes coulées et transférées dans le tube RMN, les cellules ont été équilibrées avec du glucose 12C dans du milieu KH pour permettre aux billes de se déposer dans leur position finale dans le tube RMN et d'établir un état d'équilibre métabolique avant l'introduction de Milieu 13C-glucose. Les spectres 31P ont été collectés avant l'introduction du milieu marqué et à la fin de l'expérience pour évaluer la charge énergétique des cellules. La vanne d'injection a été commutée pour initier l'impulsion de milieu marqué. Le métabolite marqué a été chassé par le flux continu de milieu non marqué. L'écoulement a été collecté par incréments de 1,8 ml pour évaluer la fuite cellulaire et l'exportation de métabolites à partir des cellules en acquérant séparément les spectres HSQC.

Tous les spectres RMN ont été enregistrés à 300 K à l'aide d'un spectromètre RMN Avance III 600 MHz équipé d'une cryosonde QCI-P (Bruker). Des spectres 1H édités par isotope 13C unidimensionnel ont été acquis avec 32 scans en utilisant la cohérence quantique unique hétéronucléaire éditée par 13C, HSQC, expérience43. Les largeurs spectrales dans les dimensions 1H et 13C étaient respectivement de 16 et 80 ppm et ont été numérisées par 2048 et 1 points dans les dimensions 1H et 13C, respectivement. Le temps d'acquisition pour chaque spectre transitoire était de 47 s. Pour chaque expérience, un spectre 1H édité par l'isotope 13C a été collecté avant l'injection du glucose marqué au 13C pour établir une lecture de base des métabolites présents dans l'échantillon. Après l'injection, 500 spectres ont été collectés consécutivement sur une période de 5,5 h permettant de surveiller la disposition du 13C-glucose au fur et à mesure qu'il progressait à travers différentes voies métaboliques. Un spectre de corrélation bidimensionnel 13C-1H a été acquis avec 32 balayages à l'aide d'un programme d'impulsions HSQC édité 13C43. Les largeurs spectrales dans les dimensions 1H et 13C étaient respectivement de 16 et 80 ppm et ont été numérisées par 2048 et 512 points dans les dimensions 1H et 13C, respectivement.

Avant chaque essai, un spectre 31P découplé de protons a été collecté avec des balayages de 5 k et un délai de recyclage de 1 s pour permettre d'évaluer l'état métabolique de la cellule. Le spectre 31P était centré à -10 ppm, correspondant à 242,935 MHz, et la largeur spectrale dans la dimension 31P était de 30 ppm. L'intensité maximale du 31P à -11,5 ppm contient de l'α-ATP, de l'α-ADP, du NAD+ et du NAD(H), qui sont tous des métabolites vitaux pouvant être utilisés pour évaluer la vitalité cellulaire20. Tous les spectres ont été traités avec Topspin version 3.2 (Bruker).

Pour les études métaboliques, les spectres HSQC 1H-13C ont été traités en utilisant Topspin (v3.2, Bruker) et MatLab en utilisant des scripts internes (méthodes supplémentaires). Les intensités maximales ont été calculées comme I = (I/HEPES)–(Iref/HEPESref), où I/HEPES représente l'intensité maximale normalisée avant que le bruit de fond, Iref/HEPESref, ne soit soustrait et HEPES est l'intensité maximale de HEPES à 3,08 ppm. Le nombre de chaque expérience HSQC dans la série a été indexé avec une intensité normalisée correspondante pour le glutamate, l'alanine et le lactate à 2,28, 1,41 et 1,26 ppm, respectivement. Cela a été tracé dans GraphPad Prism pour créer une visualisation x, y de l'impulsion/pic moyen complété en 13C pour chaque métabolite au cours de chaque expérience.

Le changement d'intensité de chaque impulsion de métabolite au fil du temps a été analysé. Les temps des fronts avant et arrière de l'impulsion ont été déterminés à partir de modèles de régression exponentielle qui ont fourni le meilleur ajustement. Le modèle d'association à une phase de GraphPad Prism a été utilisé pour ajuster les intensités de 13C-glucose sur le bord d'attaque de l'impulsion

et le modèle de décroissance à une phase a été utilisé pour ajuster le bord de fuite

où \({\mathrm{Y}}_{\mathrm{o}}\) est l'intensité initiale d'un pic au temps zéro, Plateau est l'intensité maximale (pour l'association) et minimale (pour la décroissance) du pic, K = 1/tRG ou 1/tFG sont respectivement les constantes de temps de montée et de descente réciproques, et t est le temps en secondes. Étant donné que la concentration de glucose intracellulaire, ~ 0,5 mM64, est dix fois inférieure à la concentration de glucose dans le tampon KH (5 mM), la contribution du glucose intracellulaire au signal RMN global du glucose est négligeable.

Pour le lactate, l'alanine et le glutamate, le modèle d'association à deux phases de GraphPad Prism a été utilisé pour ajuster les intensités sur le bord d'attaque de l'impulsion

où K = 1/tP, la constante de temps réciproque pour la production de métabolites et 0 ≤ x ≤ 1 est un paramètre qui attribue le pourcentage de chaque composante exponentielle à l'ajustement global. Notez que ARo et AP dans Eq. 1 correspondent respectivement à x(Plateau –Yo) et (1-x)(Yo – Plateau). Le modèle de décroissance à deux phases a été utilisé pour ajuster le bord de fuite

où K = 1/tC, la constante de temps réciproque pour la clairance des métabolites. Notez que AFo et AC dans Eq. 2 correspondent respectivement à x (Plateau–Yo) et (1-x)(Yo–Plateau). Sur la base des résultats d'ajustement, les valeurs de x dans (5) et (6) sont négligeables (tableau supplémentaire 7).

À l'avant-garde de l'impulsion de 13C-glucose, les changements de concentration du métabolite libre marqué au 13C A*, avec le flux, J et la concentration isotopique à l'état d'équilibre A, au cours du temps t, peuvent être décrits par un profilage de flux cinétique standard, KFP , équation65,66 en tenant compte de la non-idéalité de l'impulsion de glucose 13C et en ajoutant un terme phénoménologique f1(A*, t) qui décrit la possibilité que le métabolite soit lié de manière covalente ou non covalente à un récepteur trop grand à observer par RMN :

L'équation décrit l'évolution temporelle des métabolites intracellulaires tels que l'alanine et le glutamate. Pour les métabolites excrétés tels que le lactate, le taux de dilution, DR, dans le volume d'échantillonnage RMN ~ 200 µL, V, du bioréacteur est égal à F/V67, où F, le débit du bioréacteur est ~ 200 μL/min. Le temps de dilution, 1/DR ~ 1 min, est beaucoup plus court que tP et tC, les temps caractéristiques de production et de clairance des métabolites marqués. Par conséquent, les métabolites extracellulaires sont rapidement évacués du volume actif et ne contribuent pas au signal RMN observé.

En supposant que le métabolite marqué subit un échange chimique entre les états libre et lié en présence de la contrepartie non marquée et que la concentration des métabolites liés est bien inférieure à la concentration totale des métabolites ou à la concentration des sites de liaison, le f1(A*, t) le terme devient68 (voir aussi les équations (18) et (21)) :

où K est le paramètre de liaison caractéristique et α est le taux de liaison caractéristique. Il est important de noter que le terme KA* exp(–αt) s'approche de zéro lorsque le temps tend vers l'infini, reflétant le fait qu'aucun changement net de concentration dû à la liaison ne sera observé lorsque le système est équilibré avec des métabolites marqués. La solution de cette équation différentielle du premier ordre peut être trouvée en remplaçant Eq. (8) dans l'éq. (7)

et en utilisant le facteur d'intégration, IF69

En général la solution de (9) n'est possible que numériquement. Cependant, l'expression de IF est simplifiée lorsque la liaison au métabolite est non spécifique et αt < < 1. Dans ce cas, la solution de l'Eq. (10) réduit à

où yo1, AoR et A1 sont des constantes déterminées pour s'adapter au profilage du flux cinétique au bord d'attaque (Rise) de l'impulsion de 13C-glucose. A noter que tP = 1/(J/A + K) est l'échelle de temps caractéristique de la montée du signal du métabolite observé par RMN pour le front avant de l'impulsion 13C-glucose et correspond numériquement au temps nécessaire pour passer de l'état initial à 1/e ~ 0,63 du niveau de saturation. Fait important, tP est plus court que le temps caractéristique tch = A/J65,66 pour le changement de la concentration totale du métabolite marqué. Ce résultat confirme que la liaison des métabolites intracellulaires module la KFP dans la métabolomique basée sur la RMN intracellulaire.

Au bord arrière de l'impulsion 13C-glucose, les changements de concentration d'un métabolite libre marqué au 13C, A*, peuvent également être décrits par l'équation KFP en tenant compte de la non-idéalité de l'impulsion 13C-glucose et en ajoutant le terme phénoménologique f2(A*, t) = KA* exp(–αt)

En supposant que la même condition, αt < < 1, est vraie, la solution de l'Eq. (10) réduit à

où yo2, AoF et A2 sont des constantes déterminées pour s'adapter au profilage du flux cinétique au bord de fuite (chute) de l'impulsion de 13C-glucose. Notez que le temps caractéristique de la clairance dans le signal de métabolite observé par RMN, tC = 1/(J/AK), est supérieur à tP. Dans ce cas, le temps caractéristique et les paramètres de liaison, tch et K, sont définis comme tch = 2/(1/tP + 1/tC) et K = (1/tP-1/tC)/2. Ce résultat prouve que la liaison des métabolites intracellulaires conduit à une KFP asymétrique en ce qui concerne la montée et la chute du signal de l'impulsion de 13C-glucose et que la RMN intracellulaire peut quantifier la contribution de la liaison des métabolites aux flux métaboliques dans les cellules vivantes.

Un modèle de liaison compétitive de métabolites marqués de concentration [A*] en présence de métabolites non marqués de concentration [A] a été utilisé pour décrire l'effet de la liaison sur la concentration de métabolites libres marqués68. Ce système est décrit par deux équations de taux couplées

et

où [A*R] et [AR] sont les concentrations de métabolites liés marqués et non marqués, respectivement, k1 et k2 sont les constantes de vitesse marche et arrêt, et [R] est la concentration des sites de liaison libres. Si les concentrations totales de métabolites marqués et non marqués et de sites de liaison sont [A]tot, [A*]tot et N, respectivement, alors [A*] = [A*]tot − [A*R], [A] = [A]tot – [AR] et [R] = N − [A*R] − [AR]. Fait important, [A*]tot + [A]tot = [A]ss, où [A]ss est la concentration d'un métabolite à l'état d'équilibre isotopique. En général, (14) et (15) sont des équations différentielles non linéaires et ne peuvent être résolues que numériquement. Cependant, si la concentration de métabolites liés est beaucoup plus petite que la concentration totale de métabolites, Eqs. (14) et (15) sont linéaires et peuvent être résolus exactement68. La solution dépend des conditions initiales

quand [A*R] t = 0 = 0 et

quand \(\left[ {{\text{A}}^{*} {\text{R}}} \right]_{{{\text{t }} = \, 0}} = {\text{ N k}}_{{1}} {\text{A}}^{*}_{{{\text{tot}}}} /\left( {{\text{k}}_{1} } \left[ {\text{A}} \right]_{{{\text{ss}}}} + {\text{k}}_{{2}} } \right)\).

Il est important de noter que le changement de concentration du métabolite lié au fil du temps peut être décrit en différenciant (14) et (15) et en présentant le résultat comme

où K = N k1 et α = k1 [A]ss + k2. Négatif d[A*R]/dt définit f1(A*, t) dans Eq. (7) et correspond aux conditions initiales [A*R]t = 0 = 0 et d[A*R]/dt positif définit f2(A*, t) dans l'Eq. (12) et correspond à la condition initiale [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2).

Les équations (14) et (15) sont également linéaires lorsque la concentration des métabolites liés est beaucoup plus petite que la concentration totale des sites de liaison, N. Dans ce cas, la solution dépend également des conditions initiales

quand [A*R] t = 0 = 0 et

quand [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2). Il est important de noter que le changement de concentration du métabolite lié au fil du temps peut également être décrit en différenciant (19) et (20) et en présentant le résultat comme

où K = N k1, et α = k1 N + k2. Dans ce cas, d[A*R]/dt négatif définit f1(A*, t) et correspond aux conditions initiales [A*R]t = 0 = 0 et d[A*R]/dt positif définit f2( A*, t) et correspond à la condition initiale [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2). [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2). Solutions numériques pour Eqs. (14) et (15) dans le cas général où [AR] ou [A*R] sont comparables à [A]tot ou [A*]tot est présenté dans la Figure supplémentaire 5. Ces équations peuvent toujours être ajustées à l'aide d'une exponentielle fonctionnent comme Eq. (18) avec un facteur R2 meilleur que 0,99 indiquant qu'une exponentielle est une bonne approximation même dans le cas général.

Des plaques à six puits ont été ensemencées avec 3 × 105 cellules HEK 293T dans 2 mL de milieu Opti-MEM/5 % FBS et incubées dans 5 % de CO2 pendant 20 h à 37 °C. Dix µL de LF dans 200 µL d'OptiMEM ont été ajoutés au premier puits et 5 µg d'ARNm de luciférase modifié plus 10 µL de LF dans 200 µL d'OptiMEM à un second puits. Les transfections ont été incubées dans une chambre de croissance pendant 5 h dans 5 % de CO2 à 37 °C. Le milieu a été remplacé par 2 mL d'OptiMEM/5 % FBS préchauffé et les cellules ont pu récupérer pendant 24 h dans la chambre de croissance (28 h de repos). Le processus a été répété pour deux autres puits et la plaque a été incubée pendant 4 h dans la chambre de croissance (4 h de repos). Avant la fin de l'incubation de 4 h, l'antimycine A, qui inhibe le complexe de transport d'électrons, a été ajoutée à un autre puits à une concentration de 1,5 µM et incubée pendant 1 h. Le puits a été lavé une fois avec de l'OptiMEM chaud/FBS à 5 % et réapprovisionné avec 2 mL du même milieu. Les cellules ont été récoltées dans les puits avec de la trypsine-EDTA comme décrit ci-dessus et transférées dans des tubes Eppendorf de 1, 5 ml, lavées deux fois avec du PBS modifié chaud, du PBS contenant 1 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 et 5, 5 mM de glucose. Enfin, tous les puits ont été colorés avec du MitoSOX 4 μM dans du PBS modifié pendant 30 min dans la chambre de croissance. Les cellules ont été centrifugées à 300 g pendant 5 min et lavées deux fois avec du PBS modifié et re-centrifugées. Les cellules ont été remises en suspension dans 80 µL de PBS modifié et 10 µL ont été aliquotés dans chacun des quatre puits d'une plaque noire 384w (# 784 086, Greiner Bio-One). La plaque a été lue sur un lecteur de plaque Synergy H1 (BioTek) avec une excitation à 510 nm et une émission à 580 nm. Dix µL de chaque suspension cellulaire ont été dilués dans 245 µL de PBS et le nombre de cellules a été compté manuellement à l'aide d'un hémocytomètre.

Des lamelles rondes en verre de 15 mm de diamètre (Ted Pella) ont été recouvertes de solution Cell-Tak (Corning) selon les instructions du fabricant. Les cellules HEK 293T ont été cultivées et traitées comme les essais sur plaque ROS avec les modifications suivantes. Une fois les cellules transfectées, le milieu rafraîchi et reposé pendant 28 ou 4 h, tous les puits ont été colorés en ajoutant Mito Tracker Deep Red FM à une concentration finale de 50 nM et incubés pendant 30 min à 37 ° C. Les puits ont été lavés avec du PBS et les cellules récoltées avec 400 µL de trypsine/EDTA, neutralisées avec 2 mL d'OptiMEM/5%FBS, centrifugées, lavées deux fois avec du PBS modifié, remises en suspension dans des tubes Eppendorf dans le même tampon contenant 4 µM MitoSOX. Les cellules ont été incubées à 37 ° C pendant 10 min, lavées et remises en suspension dans 300 µL de PBS modifié et ajoutées aux lamelles traitées au Cell-Tak pour fixation dans la chambre de croissance pendant 20 min. L'un des puits, contenant des cellules HEK 293T non transfectées, a été traité avec 1 µM d'Antimycine-A. Après fixation, tous les puits ont été lavés deux fois avec du PBS. Trois cents µL de formaldéhyde à 4 % ont été ajoutés et les cellules ont été fixées pendant 10 min à 37 °C. Les cellules ont été lavées avec du PBS et incubées pendant 10 min avec 1 μg/mL de colorant Hoechst 33 258 dans du PBS à température ambiante. Les lamelles ont été lavées deux fois avec du PBS et montées sur des lames de verre à l'aide de Fluoromount G (Electron Microscopy Sciences). Les cellules ont été imagées le lendemain à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss Microscopy) avec un objectif 63 × et analysées avec ImageJ (USA National Institute of Health, https://imagej.nih.gov/ij/).

Pour établir la signification statistique entre les paramètres résolus moyens, des tests t non appariés ont été effectués à l'aide de Prism (GraphPad).

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et son dossier d'information complémentaire.

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Le projet décrit a été soutenu par les numéros de récompense 1P01HL146367-01 et R01GM085006 du National Institute of Health des États-Unis. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement le point de vue officiel du NIH.

Département de chimie, Université d'État de New York, Albany, NY, 12222, États-Unis

Nicholas Sciolino, Sergey Reverdatto, Aaron Premo, Leonard Breindel, Jianchao Yu, Gregory Theophall, David S. Burz et Alexander Shekhtman

Georgia Tech, École de génie mécanique, Atlanta, GA, 30332, États-Unis

Anna Liu et Todd Sulchek

Université de New York, Grossman School of Medicine, New York, NY, 10016, États-Unis

Ann Marie Schmidt & Ravichandran Ramasamy

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NS, DB, AMS, RR et AS ont écrit le texte principal du manuscrit, SR, AL et TS ont préparé les Fig. 1 et 6, AP préparé Fig. 2, NS, JY et GT préparés Fig. 3, NS préparés Figs. 4 et 5 et Documents supplémentaires, Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Alexandre Shekhtman.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Sciolino, N., Reverdatto, S., Premo, A. et al. L'ARN messager dans les nanoparticules lipidiques sauve les cellules HEK 293 du dysfonctionnement mitochondrial induit par les lipides, tel qu'étudié par la spectroscopie RMN à chasse d'impulsions en temps réel, RTPC-NMR. Sci Rep 12, 22293 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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Reçu : 22 août 2022

Accepté : 14 décembre 2022

Publié: 24 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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