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Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 798 (2023) Citer cet article

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Le virus respiratoire syncytial (VRS), le métapneumovirus humain (HMPV) et le virus parainfluenza humain de types un (HPIV1) et trois (HPIV3) peuvent provoquer une maladie grave et la mort chez les patients immunodéprimés, les personnes âgées et les personnes atteintes d'une maladie pulmonaire sous-jacente. Un anticorps monoclonal protecteur existe pour le VRS, mais son utilisation clinique est limitée aux populations infantiles à haut risque. Par conséquent, les options thérapeutiques pour ces virus dans les populations de patients vulnérables sont actuellement limitées. Nous présentons ici la découverte, la caractérisation in vitro et les tests d'efficacité in vivo de deux anticorps monoclonaux neutralisants croisés, l'un ciblant à la fois HPIV3 et HPIV1 et l'autre ciblant à la fois le RSV et le HMPV. L'anticorps 3 × 1 est capable de cibler plusieurs virus parainfluenza ; l'anticorps MxR partage des caractéristiques avec d'autres anticorps monoclonaux précédemment signalés qui sont capables de neutraliser à la fois le RSV et le HMPV. Nous avons obtenu des structures en utilisant la cryo-microscopie électronique de ces anticorps en complexe avec leurs antigènes à une résolution de 3, 62 Å pour 3 × 1 lié à HPIV3 et à 2, 24 Å pour MxR lié à RSV, fournissant une base structurelle pour la liaison et la neutralisation in vitro. Ensemble, un cocktail de 3 × 1 et de MxR pourrait avoir une utilité clinique en fournissant une large protection contre quatre des virus respiratoires qui causent une morbidité et une mortalité importantes chez les personnes à risque.

Les virus respiratoires sont une cause majeure de décès dans le monde, avec environ 2,7 millions de décès attribuables en 20151. Bien qu'un vaccin pour prévenir l'infection par le VRS puisse être à l'horizon2,3, les vaccins protecteurs contre le HMPV, le HPIV3 et le HPIV1 ne sont pas encore cliniquement disponibles. Même si des vaccins protecteurs existaient pour ces quatre virus respiratoires, la vaccination des individus hautement immunodéprimés permet rarement d'obtenir une immunité protectrice. De plus, la vaccination avant les thérapies immuno-ablatives est souvent inefficace ou diminue rapidement, ne permettant pas de maintenir une protection durable4,5,6. Ensemble, le RSV, le HMPV, le HPIV1 et le HPIV3 représentent une menace sérieuse pour les patients immunodéprimés et, avant la pandémie de COVID-19, ils étaient responsables de la majorité des infections virales des voies respiratoires inférieures chez les receveurs de greffe de cellules souches hématopoïétiques7,8. Chez les adultes présentant d'autres facteurs de risque, la charge de morbidité due au HMPV et aux virus parainfluenza est également comparable à celle du VRS9,10. En outre, à l'exception des rhinovirus, le VRS, le HMPV et les virus parainfluenza représentent également collectivement la plupart des virus respiratoires identifiés chez les adultes hospitalisés avant 202011,12.

Bien que les stratégies d'atténuation pendant la pandémie de COVID-19 telles que le masquage, la distanciation sociale et les fermetures aient entraîné une baisse des cas d'autres virus respiratoires pendant les saisons de rhume et de grippe 2020-2021, les cas de VRS, de HMPV et de HPIV recommencent à augmenter et devraient revenir aux niveaux de circulation pré-pandémiques dans les prochaines années9,10. En fait, les modèles prévoient de grandes épidémies futures de virus respiratoires autres que le SRAS-CoV-2 en raison d'une augmentation de la taille de la population sensible après une période de propagation réduite13. De plus, étant donné que les virus respiratoires endémiques ont tendance à circuler de façon saisonnière, des co-infections avec plus d'un virus respiratoire peuvent survenir et ont été associées à de moins bons résultats dans les populations vulnérables14,15,16.

L'administration d'anticorps monoclonaux neutralisants (mAbs) offre une alternative efficace à la vaccination pour se protéger contre les infections virales. Bien que le palivizumab mAb anti-RSV ait reçu l'approbation de la FDA en 1998 comme prophylaxie chez les nourrissons à haut risque17, il reste relativement inutilisé chez les enfants ou les adultes immunodéprimés plus âgés. Depuis l'approbation du palivizumab, des anticorps monoclonaux encore plus puissants contre le VRS ont fait l'objet d'essais cliniques, l'objectif principal étant de remplacer le palivizumab comme traitement de référence pour la prophylaxie chez les nourrissons à haut risque. Cette concentration a été motivée en partie par le fait que le VRS cause jusqu'à 80 % des bronchiolites chez les nourrissons18,19. Cependant, chez les adultes immunodéprimés, le paysage des virus respiratoires est beaucoup plus hétérogène7,8. Par conséquent, une stratégie efficace pour réduire le fardeau global du large éventail d'infections des voies respiratoires inférieures chez les adultes à risque et les patients immunodéprimés doit s'appuyer sur le ciblage de plusieurs virus simultanément, plutôt que sur un seul virus. Malgré les progrès de la recherche sur la prévention du VRS, le rôle de l'immunisation passive contre d'autres virus respiratoires reste mal défini et aucun mAb n'est actuellement disponible en clinique qui puisse prévenir l'infection par le HMPV, le HPIV1 ou le HPIV3.

Pour obtenir efficacement une protection plus large contre ces virus, nous avons cherché à identifier des mAb à neutralisation croisée qui pourraient cibler plus d'un virus à la fois. Le RSV, le HMPV, le HPIV3 et le HPIV1 produisent tous des protéines de fusion (F) de classe I qui sont des glycoprotéines de surface essentielles spécialisées dans la médiation de la fusion entre les membranes virales et celles des cellules hôtes lors de l'entrée virale. HPIV1 et HPIV3 appartiennent au même genre Respirovirus et leurs séquences F partagent 65 % d'homologie de séquence d'acides aminés. Le RSV et le HMPV appartiennent à la même famille des Pneumoviridae et leurs séquences F partagent environ 54 % d'homologie. La transition des protéines F entre une conformation métastable de préfusion (preF) et une conformation stable de postfusion (postF)20,21. Étant donné que preF est la principale conformation des virions infectieux, les anticorps anti-preF ont tendance à être les plus puissants pour neutraliser le virus22,23,24,25. Semblables au RSV, les protéines HPIV3 et HPIV1 F dans la conformation de préfusion provoquent des titres d'anticorps neutralisants plus élevés par rapport à la conformation de postfusion26. Dans une étude précédente, nous avons utilisé la protéine préF HPIV3 stabilisée pour identifier et caractériser plusieurs anticorps neutralisants contre HPIV327. Pour le HMPV, même si les anticorps ciblant la conformation post-fusion contribuent également à neutraliser les titres d'anticorps28, le HMPV postfusion F ne provoque pas d'anticorps neutralisants croisés contre le RSV29. Dans la présente étude, nous avons exploité l'homologie entre les protéines F apparentées et nous nous sommes concentrés sur leurs conformations préF pour identifier et cloner deux puissants mAb à neutralisation croisée, 3 × 1 et MxR, à partir de cellules B mémoire humaines. 3 × 1 neutralise à la fois HPIV3 et HPIV1, tandis que MxR neutralise efficacement à la fois HMPV et RSV. Ensemble, 3 × 1 et MxR constituent un cocktail d'anticorps capable d'obtenir une protection simultanée contre plusieurs virus, ce qui pourrait être bénéfique pour les populations à risque qui sont fortement désavantagées sur le plan immunologique lorsqu'elles sont infectées par des virus respiratoires.

Étant donné que pratiquement tous les humains ont été exposés au RSV, au HMPV, au HPIV3 et au HPIV130, il n'était pas nécessaire de présélectionner la séropositivité des donneurs. Parce qu'il y a un manque de mAb actuellement en développement contre les virus parainfluenza, nous avons d'abord concentré nos efforts sur le dépistage des cellules B neutralisantes croisées HPIV3/HPIV1. Étant donné que nous n'avons pas été en mesure de produire la protéine F de HPIV1 dans la conformation préF, nous avons utilisé la protéine F de HPIV3 seule pour effectuer ce criblage en tirant parti d'une stratégie d'appât et de commutation (Fig. 1a, b). Ici, les cellules B de liaison HPIV3 ont été isolées en incubant 200 millions de splénocytes humains avec des tétramères de HPIV3 preF conjugués à l'allophycocyanine (APC) et des tétramères de HPIV3 postF conjugués à APC/Dylight755, suivis d'un enrichissement magnétique avec des microbilles anti-APC. Neuf cents cellules B qui liaient les tétramères préF HPIV3 mais pas les tétramères postF ont été triées individuellement dans des puits contenant des cellules nourricières 3T3 productrices de CD40L/IL2/IL21, puis incubées pendant 13 jours pour stimuler la sécrétion d'anticorps dans les surnageants de culture. Pour identifier les puits contenant des cellules B candidates exprimant des anticorps neutralisants croisés, les surnageants de culture des cellules B liant HPIV3 triées individuellement ont été mélangés avec le virus HPIV1 vivant et criblés pour leur capacité à réduire la formation de plaques (Fig. 1a, c). Deux des 900 cellules B liant HPIV3 ont produit des anticorps capables de neutraliser HPIV1 (Fig. 1c). À partir de ces cellules, les gènes des chaînes lourdes (VH3-23) et légères (Vλ3-19) exprimés ont été séquencés et clonés avec succès pour produire un mAb avec une capacité de neutralisation croisée contre HPIV3 / HPIV1 que nous avons nommé 3 × 1 (Fig. 1b, c). 3 × 1 a été isolé à partir d'une cellule B exprimant l'isotype IgA. Étant donné que le palivizumab et la plupart des autres mAb développés contre les virus respiratoires utilisent une région constante IgG1, 3 × 1 a également été cloné et produit pour une étude plus approfondie en tant qu'IgG1.

une approche Bait-and-switch utilisant un seul antigène pour identifier les cellules B qui neutralisent de manière croisée un autre virus apparenté. Les lymphocytes B se liant à HPIV3 de la rate humaine ont été marqués avec des tétramères conjugués à l'APC de HPIV3 preF. b Tracé de cytométrie en flux des cellules B de liaison HPIV3 préF après déclenchement pour les cellules vivantes, CD3−CD14−CD16−CD19+CD20+ (cellules B), IgD−/IgM− (commutation d'isotype) et APC/Dylight755− HPIV3 postF− (pour exclure les cellules se liant à HPIV3 postF, APC ou streptavidine). La fraction liée contient des cellules enrichies magnétiquement à l'aide de microbilles spécifiques à l'APC. Les nombres sur les parcelles sont des pourcentages du nombre total de cellules dans la porte. La boîte rouge indique la cellule B à partir de laquelle 3 × 1 mAb a été dérivé. c Distribution de fréquence des plaques HPIV1 par puits à partir de l'écran de neutralisation. La ligne pointillée indique le nombre moyen de plages dans les puits de contrôle négatif contenant le virus en l'absence d'anticorps. La barre rouge comprend les données du puits qui contenait la cellule B productrice de 3 × 1. d La cinétique de liaison de 3 × 1 IgG (en haut) et de Fab (en bas) à HPIV3 preF a été mesurée par interférométrie de biocouche (BLI) pour déterminer les affinités apparentes (KD). L'association avec la sonde préchargée 3 × 1 à HPIV3 a été mesurée pendant 300 s, suivie d'une dissociation pendant 1200 s. Les mesures sont normalisées par rapport à un anticorps témoin d'isotype. Les cellules Vero ont été infectées par HPIV3 ou HPIV1 en présence de dilutions en série de palivizumab ou 3 × 1. La ligne médiane en pointillé indique PRNT60. Les points de données sont la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. Panneau (a) créé avec BioRender.com.

Bien que nous n'ayons pas stabilisé la protéine F de HPIV1 dans la conformation préF, nous avons estimé l'affinité de liaison apparente entre 3 × 1 et la protéine F de HPIV3 dans la conformation préF. En tant qu'IgG, 3 × 1 se liait étroitement à la protéine préF de HPIV3 (KD < 10−12 M) (Fig. 1d). L'affinité de liaison de 3 × 1 Fab était plus faible (KD = 1, 9 × 10 −7 M), en raison d'une dissociation rapide, ce qui indique qu'une liaison simultanée par les deux Fab est probablement nécessaire pour maintenir la liaison (Fig. 1d). Le pouvoir neutralisant de 3 × 1 a été déterminé par un test de neutralisation par réduction de plaque à 60 % (PRNT60) utilisant un virus vivant pour infecter des cellules Vero. 3 × 1 avait un pouvoir de neutralisation tout aussi élevé contre HPIV1 et HPIV3, avec un PRNT60 de 352 et 242 ng/mL, respectivement (Fig. 1e). Une enquête plus approfondie a révélé que 3 × 1 bloquait la propagation de cellule à cellule et la formation de syncytia par HPIV3 en culture cellulaire (Fig. S1). Ces résultats suggèrent que l'épitope de 3 × 1 pourrait être fonctionnellement conservé entre HPIV3 et HPIV1.

Étant donné que le paysage antigénique de HPIV3 preF n'est pas bien caractérisé, nous avons d'abord effectué des expériences de liaison de compétition croisée pour évaluer les sites antigéniques sur HPIV3 preF permettant la neutralisation. L'épitope du mAb 3 × 1 à neutralisation croisée ne semblait pas chevaucher les épitopes des mAb que nous avions précédemment isolés et qui se lient à l'apex de preF et neutralisent HPIV3 (Fig. 2a)27. Cependant, l'épitope de 3 × 1 semble chevaucher l'épitope d'un anticorps PI3-A12 précédemment décrit, qui se lie à un site antigénique que nous avons nommé site X27. Pour déterminer comment 3 × 1 interagit avec le site X, nous avons utilisé cryo-EM. De nombreuses particules de trimère HPIV3 preF avaient <3 Fab liés, bien que le Fab soit en excès molaire de trimère lors de la préparation de l'échantillon (Fig. S3a). Nous avons obtenu une structure de 1 Fab en complexe avec HPIV3 résolu à 3, 62 Å (Fig. S2a et Tableau S1). Nous avons également obtenu une structure de 3 Fab liés à HPIV3 ; cette carte était limitée à une résolution de 4,3 Å (Figs. S2a et S3a). Nous n'avons remarqué aucune variation significative entre le protomère préF lié et le protomère préF non lié (RMSD = 0,721 sur 360 Cα) dans la structure C1. Par conséquent, nous avons utilisé la structure à plus haute résolution pour la construction du modèle. 3 × 1 lie le domaine III de HPIV3 preF, faisant saillie perpendiculairement et ne liant qu'un seul protomère, sans contacts supplémentaires avec d'autres régions (Fig. 2b). Seuls quatre des six CDR sont impliqués dans la liaison, CDRH1 et CRDL2 étant trop courts pour entrer en contact avec la surface de la glycoprotéine (Fig. 2c, d). 3 × 1 lie le site X avec une surface enterrée totale (BSA) de ~ 812 Å2, dont le VH contribue ~ 612 Å2 et le VL contribue ~ 200 Å2 (Fig. 2b, c). La comparaison avec la structure PI3-A12: HPIV3 a indiqué que 3 × 1 se lie au même site mais est tourné par rapport à HPIV3 preF (Fig. S3b). Alors que 3 × 1 neutralise à la fois HPIV3 et HPIV1, PI3-A12 ne neutralise que HPIV327 et 3 × 1 partage peu de similitude de séquence CDR avec PI3-A12 (Fig. S3c). En raison de l'absence d'une structure à haute résolution pour le complexe PI3-A12: HPIV3, nous n'avons pas pu déterminer si le LC 3 × 1 chevauche le PI3-A12 LC ou HC. 3 × 1 et PI3-A12 peuvent donc se lier à des épitopes distincts au sein du même site de HPIV3 preF, car ils présentent une variation de séquence significative au niveau des résidus clés de 3 × 1 qui facilitent la liaison (Fig. S3c).

une mesure BLI de la capacité du mAb répertorié sur le côté gauche du tableau à empêcher la liaison du mAb répertorié en haut, exprimée en pourcentage de chute du signal maximal par rapport au signal maximal en l'absence de mAb concurrent. b Structure Cryo-EM de 3 × 1 Fab en complexe avec HPIV3 preF. À gauche, une vue de haut en bas de la carte 3 × 1: HPIV3 est affichée avec un Fab (VH représenté en violet, VL en rose) et HPIV3 preF en nuances de gris. À droite, une représentation de surface du complexe est montrée tournée de 90° avec le domaine III en bleu clair et le domaine II en jaune sur un protomère. Les glycanes sont représentés par des sphères vertes. c Tracés BSA pour chaque résidu Fab qui interagit avec le protomère préF, au-dessus d'un alignement de séquences sur la lignée germinale VH et VL pour 3 × 1. d Vue détaillée du site de liaison 3 × 1 avec uniquement les CDR en interaction montrées dans le dessin animé, pivotées de 60 ° à partir du panneau (b). Les cases montrent les emplacements des panneaux (e) et (f). e Vue agrandie du site de liaison CDRH3 tourné de 40° à partir du panneau (b). f Vue agrandie du site de liaison CDRL3 tourné de 110° à partir du panneau (b). e, f Les résidus CDR qui n'entrent pas en contact avec HPIV3 preF ont été masqués pour plus de clarté.

Une analyse plus approfondie de la résolution locale de notre carte a indiqué que le site de liaison avait une résolution plus élevée d'environ 3, 0 Å par rapport à la résolution globale de 3, 62 Å (Fig. S1a). Les VH et VL 3 × 1 lient ensemble spécifiquement la fente entre l'hélice HRA et un motif feuille-tour-feuille, une courte région contiguë de HPIV3 (Figs. S4a – d et S5a, b). Cette région est cruciale pour le réarrangement préF à postF, avec à la fois l'hélice HRA et le motif feuille-tour-feuille affichant> 9 Å de mouvement pendant le réarrangement26. Le HRA peut également jouer un rôle dans la neutralisation de HPIV1 puisque 3 × 1 interagit probablement avec le HRA sur HPIV1 (Fig. S4e). En raison du mouvement important requis de ce site pendant la fusion et de sa puissance en tant qu'épitope neutralisant pour RSV preF31, la liaison 3 × 1 à cet emplacement présente une base structurelle solide pour la puissance neutralisante élevée de 3 × 1. Le CDRH2 et le CDRH3 de 3 × 1 forment plusieurs saillies dans des rainures à la surface de HPIV3 preF en utilisant des résidus non polaires (Fig. 2d, e). His52AHC et Phe56HC (CDRH2) ainsi que Leu100BHC et Leu100FHC (CDRH3) représentent environ 55 % de la BSA VH totale (Fig. 2c). La plupart des autres résidus de contact dans le VH sont des résidus polaires qui forment des contacts avec généralement <50 Å2 de BSA. Les résidus VL de 3 × 1 forment des contacts avec HPIV3 preF en utilisant des groupes fonctionnels polaires et le squelette de la boucle CDR, avec CDRL1 englobant une grande saillie sur HPIV3 preF (Fig. 2c, f). Cette extension CDRL1 est prise en charge par Arg91LC, qui entre en contact avec Tyr31LC et Leu100FHC, Arg91LC formant une liaison avec Asp143 de HPIV3 preF, qui est conservée dans HPIV1 (Figs. S5a – c et S6a). Nous notons également une caractéristique mal résolue dans notre carte 3 × 1: HPIV3, qui peut être l'extrémité C-terminale de la protéine F2 après le clivage de la furine (Fig. S7a, b). Bien qu'il n'y ait pas une densité suffisante pour construire cette région, sa proximité avec le site de liaison 3 × 1 pourrait indiquer un épitope de liaison supplémentaire.

Étant donné que le RSV et le HMPV contribuent également de manière significative à la maladie chez les patients vulnérables, nous avons ensuite cherché à identifier les mAb potentiels de neutralisation croisée du HMPV/RSV qui pourraient être combinés avec 3 × 1 pour créer un cocktail puissant avec une portée élargie. Bien que de nombreux mAb ciblant le RSV et le HMPV soient déjà en développement, nous avons utilisé notre approche en exploitant des sondes tétramères fluorescentes pour identifier des cellules B uniques capables de se lier aux protéines F recombinantes du RSV et du HMPV dans la conformation préF, mais pas dans la conformation postF. Le RSV preF conjugué à l'APC, le HMPV preF conjugué à la R-phycoérythrine (PE), le RSV postF conjugué à l'APC/DyLight755 et le HMPV postF conjugué à la PE/DyLight650 ont été mélangés à 200 millions de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) avant l'enrichissement magnétique avec des microbilles anti-PE et anti-APC. Nous avons ensuite trié les cellules B à commutation d'isotype unique se liant aux protéines F du RSV et du HMPV dans la conformation préF mais pas dans la conformation postF, suivies d'un séquençage unicellulaire et du clonage de leurs récepteurs de cellules B (Fig. 3a). En utilisant cette méthode, les allèles des chaînes lourdes (VH3-21) et légères (Vλ1-40) d'une cellule B capable de se lier à la fois au RSV et au HMPV ont été séquencés et clonés en tant que mAb que nous avons nommé MxR (Fig. 3b). Cette cellule B exprimait l'isotype IgG. Comme 3 × 1, MxR a été cloné et produit sous forme d'IgG1 pour une étude plus approfondie.

a Les cellules B de sang humain se liant au RSV et au HMPV ont été marquées avec des tétramères de streptavidine conjugués à l'APC de la protéine de préfusion du RSV biotinylée (preF) et des tétramères de streptavidine conjugués au PE du HMPV preF biotinylé. b Tracé de cytométrie en flux des cellules B de liaison préF du RSV et du HMPV après déclenchement pour les cellules vivantes, CD3−CD14−CD16− CD19+CD20+ (cellules B), IgD−/IgM− (commutation d'isotype) et APC/Dylight755- HMPV postF− et PE/Dylight650−RSV postF− (pour exclure les cellules se liant au RSV/HMPV postF, APC, PE ou streptavi vacarme). La fraction liée contient des cellules enrichies magnétiquement à l'aide de microbilles spécifiques à APC et PE. Les nombres sur les parcelles sont des pourcentages du nombre total de cellules dans la porte. La boîte rouge indique la cellule B à partir de laquelle le mAb MxR a été dérivé. c Affinité apparente (KD) de MxR, MPE8 et D25 mesurée par BLI. d Les cellules Vero ont été infectées par le RSV-A, le RSV-B ou le HMPV en présence de dilutions en série de palivizumab (Pali.), D25, MPE8 ou MxR. Les points de données représentent le titre de neutralisation de la réduction de plaque à 60 % et proviennent de trois expériences indépendantes. Les astérisques indiquent ap < 0,05 en utilisant un test t bilatéral avec correction de Welch. Les nombres à côté des astérisques indiquent la valeur p exacte. Panneau (a) créé avec BioRender.com.

Nous avons comparé l'affinité de liaison apparente de MxR à l'anticorps monoclonal D25 spécifique au VRS, qui est en cours de développement sous le nom de nirsevimab pour la prophylaxie du VRS chez les nourrissons32,33. Le RSV a deux sous-types antigéniquement distincts, A et B, qui partagent 91 % d'homologie de séquence d'acides aminés au sein de la protéine F. MxR s'est lié de manière irréversible avec une affinité apparente élevée aux protéines préF des sous-types A et B du RSV (KD < 10−12 M chacun), même lorsque le temps de dissociation a été prolongé à 1200 s (Figs. 3c et S8a, d). L'anticorps monoclonal à neutralisation croisée MPE834 signalé précédemment présentait également une affinité apparente élevée pour les sous-types A et B du VRS (figures 3c et S8b, e). D25 s'est également fortement lié à la protéine préF du sous-type B du VRS, mais avec une affinité apparente environ 1 500 fois plus faible (KD = 1, 5 × 10−9 M) par rapport à sa liaison au sous-type A (Figs. 3c et S8c, f). MxR pourrait également se lier à la protéine préF du HMPV (Fig. 3c et S8g), ce qui était attendu compte tenu de la sélection délibérée des lymphocytes B se liant à la fois au RSV et au HMPV pendant le tri. Par rapport à MPE8, l'affinité de liaison apparente de MxR pour HMPV était environ 1, 6 fois plus forte (Figs. 3c et S8g, h).

Étant donné que les deux sous-types de VRS circulent dans le monde, il était important d'évaluer le pouvoir neutralisant (PRNT60) de MxR pour les sous-types A et B. Nous avons également comparé le pouvoir neutralisant de MxR avec le palivizumab, un anticorps monoclonal spécifique au VRS, qui est actuellement approuvé pour la prophylaxie contre le VRS chez les nourrissons à haut risque. Nous avons constaté que MxR neutralisait le sous-type A du VRS avec une puissance au moins 6 fois supérieure à celle du palivizumab (Figs. 3d et S9a). Contrairement au palivizumab, qui a une puissance similaire contre les deux sous-types35, MxR était également très puissant contre le sous-type B, avec une puissance 12 fois supérieure (Figs. 3d et S9b). Bien que D25 ait une plus grande puissance neutralisante contre le RSV-A (Fig. 3d), D25 aurait une puissance plus faible contre certaines souches de RSV-B et ne neutralise pas le HMPV36,37,38. MxR et MPE8 avaient une puissance similaire pour neutraliser les sous-types A et B du VRS. Cependant, MxR avait une puissance au moins 5 fois supérieure contre le HMPV, avec un PRNT60 de 148 ng/mL par rapport à 838 ng/mL pour MPE8 (Figs. 3d et S8c). Sur la base de la concentration d'anticorps nécessaire pour neutraliser 60 % du virus vivant, la puissance de MxR contre le HMPV dépassait la puissance relative du palivizumab contre le VRS (Fig. 3d).

Pour mieux comprendre la base de la neutralisation croisée observée avec MxR, nous avons obtenu une structure cryo-EM de trois Fab MxR liés au RSV preF à une résolution de 2, 24 Å (Figs. S2b, S10 et Tableau S1). MxR se lie principalement au site antigénique III sur RSV avec une disposition équatoriale des Fab autour de RSV preF. Le site antigénique III est un épitope quaternaire à la jonction des domaines I et III d'un protomère F et du domaine II du protomère F adjacent dans le sens des aiguilles d'une montre (appelé II') (figure 4a). MxR se lie avec une BSA totale de ~1094 Å2, avec VH contribuant ~694 Å2 et le VL contribuant ~400 Å2, dont ~298 Å2 entrent en contact avec le protomère F principal et ~102 Å2 entrent en contact avec le protomère F adjacent. Notre structure a révélé de nombreuses molécules d'eau espacées tout au long du site de liaison qui interviennent potentiellement dans les interactions entre le protomère Fab et préF (Fig. S11). Ceux-ci ont été omis de la figure 4 pour plus de clarté. Le mode de liaison est presque identique à l'anticorps monoclonal à neutralisation croisée MPE834 et à l'anticorps monoclonal infantile ADI-1942539, qui sont dérivés des mêmes allèles de chaîne germinale lourde (IGHV3-21*01) et légère (IGLV1-40*01). La comparaison de la BSA par résidu de RSV preF dans un complexe avec MxR, MPE8 et ADI-19425 a révélé des régions de liaison communes qui partagent une homologie de séquence élevée avec HMPV (Fig. S6b). La séquence et la structure des CDR1 et des CDR2 sont presque identiques pour les trois anticorps, MxR ayant globalement plus de mutations de la lignée germinale que les deux autres (Fig. 4b, c).

a À gauche, une vue de haut en bas de la carte DeepEMhanced MxR:RSV cryo-EM est affichée, avec MxR VH en rouge foncé, MxR VL en rouge clair et RSV preF en nuances de gris. Seul le domaine Fv du Fab est représenté. À droite, une représentation de surface de la structure est montrée tournée de 90°. Un protomère préF est coloré par ses domaines structuraux, et un MxR Fv est montré dans un contour de dessin animé. Le domaine DII du protomère adjacent dans le sens des aiguilles d'une montre est en rose clair et désigné DII 'pour le différencier du DII de l'autre protomère, coloré en violet. Les glycanes sont représentés par des sphères vertes. ( b ) Parcelles BSA pour les résidus MxR, MPE8 et ADI-19425 qui interagissent avec RSV preF, au sommet d'un alignement de séquence des gènes V de la lignée germinale. La lettre H indique des liaisons hydrogène. La lettre S indique les ponts de sel. Les résidus dans les cases colorées correspondent aux résidus indiqués dans les panneaux (d et e). c Vue détaillée du site de liaison sur RSV preF avec les CDR de MxR, MPE8 et ADI-19425 superposés et montrés dans le dessin animé. MPE8, en vert, et ADI-19425, en bleu, sont représentés en transparence. Le site antigénique III est délimité par le contour blanc. d Vue agrandie du site de liaison CDRH3 tourné de 30 ° dans le sens antihoraire à partir du panneau (c). e Vue agrandie du site de liaison CDRL3, pivotée de 65° dans le sens des aiguilles d'une montre à partir du panneau (c). Les quatre premiers résidus sont présentés comme chaîne principale uniquement pour augmenter la clarté et illustrer la similitude de CDRL3 entre les anticorps.

Les régions CDRH3 de MxR, MPE8 et ADI-19425 ont un plus grand degré de variation de séquence et de structure, avec presque aucun résidu conservé, malgré toute liaison près de l'interface DI/DII'/DIII dans le site antigénique III. Il y a une petite fente à cette interface, dans laquelle les boucles CDRH3 s'étendent à des degrés divers (Fig. 4c, d). MPE8 CDRH3 est le plus long, tandis que MxR est le plus court et ADI-19425 est de longueur intermédiaire. Notamment, ADI-19425 utilise une liaison disulfure pour stabiliser cette boucle, alors que MPE8 et MxR manquent de cette liaison (Fig. 4d)34,39. La géométrie rigide imposée par la liaison disulfure peut altérer la capacité de l'ADI-19425 à se lier au HMPV. La nécessité du MPE8 CDRH3 pour former la géométrie de boucle correcte pour se lier dans la fente du site antigénique III peut donc être une base structurelle derrière la neutralisation réduite du HMPV par MPE8 par rapport à MxR (Figs. 4c, d et 3d). En raison d'un CDRH3 relativement plus court que MPE8, MxR se lie dans cette fente sans entrer en contact avec DII', et ne nécessite donc pas de boucle étendue pour faciliter la liaison (Figs. 4d et S6b). Seul le CDRL2 de MxR contacte DII' (Fig. 4c). Lorsque les CDR sont superposées au protomère de HMPV, nous constatons que le site de liaison général est très similaire, comprenant des contributions de sites antigéniques et des identités de résidus similaires (Fig. S12a, b). Cependant, la fente de liaison disponible est plus étroite et plus courte, ce qui peut gêner stériquement les boucles ADI-19425 et MPE8 CDRH3 (Fig. S12c). Les CDRL3 montrent également une certaine variation dans les résidus en interaction (Fig. 4e). MPE8 et MxR partagent tous deux un résidu basique en position 93LC qui n'est pas partagé avec ADI-19425, et les trois anticorps présentent des arrangements de boucle légèrement différents dans les résidus 94–96LC (Fig. 4e). Cependant, les modes de liaison des CDRL3 semblent similaires, sans les caractéristiques uniques observées dans les CDRH3.

Nous avons ensuite étudié si les données de liaison et de neutralisation in vitro se traduiraient par une protection in vivo dans un modèle de provocation animale. Bien que les virus parainfluenza humains ne se répliquent pas chez la souris, la réplication des voies respiratoires supérieures et inférieures peut être démontrée chez les hamsters et les rats du coton30,40. Pour le VRS, des titres viraux comparables ont été rapportés dans les poumons de hamsters et de rats du coton41. Bien que certaines études aient observé des titres plus élevés de HMPV dans les poumons des rats du coton par rapport aux hamsters42,43, cela pourrait être lié à des différences dans la souche virale utilisée, la taille de l'inoculum et le moment de l'échantillonnage pulmonaire. Le modèle du hamster a été largement utilisé pour évaluer les vaccins candidats contre les virus parainfluenza, le VRS et le HMPV44,45,46,47,48,49,50,51,52. Étant donné que tous les virus de cette étude pouvaient se répliquer chez les hamsters44,45,51,53,54,55,56,57, nous avons effectué des tests précliniques de MxR et 3 × 1 dans le modèle du hamster doré syrien. Nous avons effectué des injections intramusculaires chez des hamsters au jour -2, infecté des hamsters par voie intranasale au jour 0 et prélevé des poumons et des cornets nasaux au jour 5 après l'infection pour évaluer l'efficacité des anticorps monoclonaux comme prophylaxie contre l'infection (Fig. 5a). Cette posologie, cette voie et ce moment d'administration sont similaires à ceux utilisés dans les modèles d'infection par le VRS chez le rat du coton41,58,59. Nous avons effectué des expériences de recherche de dose avec 3 × 1 contre HPIV3 et MxR contre RSV, en utilisant le palivizumab comme référence. Deux jours après l'injection intramusculaire de la dose de 5 mg/kg chez les hamsters, nous avons observé des concentrations sériques de mAb de 5,1 à 9,7 µg/mL (Fig. 5b). À une dose de 5 mg/kg, MxR et 3 × 1 ont complètement supprimé la réplication virale de HPIV3 et RSV, respectivement, dans les poumons (Fig. 5c, d). En revanche, le palivizumab à 5 mg/kg n'a pas complètement supprimé la réplication virale dans les poumons, même si le palivizumab et le MxR avaient une CE90 similaire contre le VRS (Fig. 5d, e). Ceci est cohérent avec les données du modèle de rat du coton dans lequel une percée d'infection avec le palivizumab à 5 mg/kg a également été observée60. L'administration prophylactique de 3 × 1 à 5 mg/kg a eu peu d'impact sur la réplication dans les cornets nasaux (Fig. 5c). Cependant, l'administration prophylactique de MxR à 5 mg / kg a réduit la réplication du RSV dans les cornets nasaux de plus de 47 fois (Fig. 5d). Cela contraste avec le palivizumab, qui n'a eu aucun effet sur la réplication du VRS dans les cornets nasaux. Étant donné que la dose de 5 mg/kg a supprimé la réplication virale du RSV et du HPIV3, nous avons également testé cette dose pour le HPIV1 et le HMPV. La réplication de HPIV1 a été complètement bloquée dans les poumons de tous les animaux sauf un et a été significativement réduite dans les cornets nasaux des hamsters ayant reçu une prophylaxie 3 × 1 (Fig. 5f). La réplication du HMPV a été significativement réduite de plus de 206 fois dans les poumons des hamsters ayant reçu une prophylaxie MxR (Fig. 5g).

a Schéma d'expériences dans lesquelles des hamsters ont reçu une injection intramusculaire de 3 × 1 ou MxR deux jours avant la provocation intranasale avec 105 pfu de virus. b Les concentrations sériques de 3 × 1 et MxR deux jours après l'administration de mAb à 5, 2,5 et 1,25 mg/kg ont été mesurées par ELISA (n = 4 animaux/dose). Dose-réponse de 3 × 1 (c) et MxR (d) sur la réplication HPIV3 et RSV, respectivement (n = 5 animaux expérimentaux/dose/virus, n = 5 cornets nasaux d'animaux témoins/virus et n = 4 poumons d'animaux témoins/virus). e Concentration efficace à 90 % (CE90) de palivizumab contre le VRS, MxR contre le VRS et 3 × 1 contre le HPIV3 d'après des expériences dose-réponse. f HPIV1 et (g) réplication du HMPV après injection avec 3 × 1 ou MxR à 5 mg/kg, respectivement (n = 8 animaux/groupe sur deux expériences indépendantes pour le HPIV1 ; et n = 10 cornets nasaux d'animaux/groupe, n = 10 poumons d'animaux expérimentaux et n = 7 poumons d'animaux témoins sur deux expériences indépendantes pour le HMPV). Les titres viraux ont été mesurés par dosage sur plaque dans des homogénats pulmonaires et nasaux de hamsters individuels à 5 jours après l'infection. Les lignes pointillées indiquent la limite de détection. Les barres représentent la moyenne et les astérisques indiquent un p bilatéral <0, 05 par le test de Mann – Whitney par rapport aux hamsters témoins injectés avec 1 × DPBS. Les nombres à côté des astérisques indiquent la valeur p exacte. Panneau (a) créé avec BioRender.com.

S'ils sont administrés ensemble sous forme de cocktail, MxR et 3 × 1 pourraient fournir une large protection contre le HMPV, le RSV, le HPIV3 et le HPIV1. Ceci est cliniquement pertinent car les quatre virus représentent ensemble la majorité des infections virales respiratoires graves chez les receveurs de greffes de cellules souches hématopoïétiques. Par rapport à la co-administration de quatre mAb (un par virus), l'utilisation de deux mAb pour cibler quatre virus permet l'administration d'une dose plus élevée de chaque mAb, ce qui pourrait maximiser l'efficacité tout en minimisant la toxicité. L'administration d'un cocktail pourrait également être utile dans le cadre de co-infections par plusieurs virus respiratoires puisque les co-infections peuvent être associées à de moins bons résultats chez les patients immunodéprimés16. Nous avons donc développé un modèle de co-infection HPIV3/RSV chez les hamsters pour évaluer l'efficacité lorsque MxR et 3 × 1 sont co-administrés ensemble. Étant donné que le test de plaque pour déterminer les titres viraux ne pouvait pas faire la distinction entre HPIV3 et RSV, nous avons développé des sondes TaqMan personnalisées pour quantifier les charges virales individuelles par PCR en temps réel. Premièrement, nous avons comparé les niveaux de HPIV3 et de RSV détectés dans les poumons d'animaux infectés par l'un ou les deux de ces virus. À l'instar des données d'études humaines suggérant que les co-infections entre le VRS et d'autres virus n'ont pas d'impact sur les titres de VRS61, nous n'avons observé aucune diminution de la réplication virale dans les poumons des animaux inoculés simultanément avec des quantités égales de VRS et de HPIV3, par rapport aux animaux inoculés avec un seul virus (Fig. 6a, b).

La charge virale spécifique de HPIV3 (a) et de RSV (b) dans des homogénats pulmonaires de hamsters co-infectés avec 105 pfu chacun de RSV et de HPIV3 a été comparée à des hamsters infectés avec 105 pfu d'un seul virus par PCR en temps réel : n = 4 animaux/infection unique et n = 6 pour la co-infection. c Schéma d'expériences dans lesquelles des hamsters ont reçu une injection intramusculaire de 5 mg/kg chacun de 3 × 1 et MxR sous forme de cocktail deux jours avant la provocation intranasale avec 105 pfu chacun de HPIV3 et RSV. La charge virale spécifique de HPIV3 (d) et de RSV (e) dans les homogénats de tissus pulmonaires et nasaux a été déterminée par PCR en temps réel à l'aide d'amorces spécifiques de HPIV3 et de RSV, respectivement. Pour HPIV3 : n = 8 cornets nasaux d'animaux/groupe, n = 8 poumons d'animaux expérimentaux et n = 7 poumons d'animaux témoins sur deux expériences indépendantes. Pour le RSV : n = 7 animaux/groupe sur deux expériences indépendantes. f Titre viral global par test de plaque dans les homogénats pulmonaires et nasaux au jour 5 après l'infection (n = 7 animaux/groupe sur deux expériences indépendantes). Les lignes pointillées indiquent la limite de détection, les barres représentent la moyenne et les astérisques indiquent un p bilatéral <0, 05 par le test de Mann – Whitney par rapport aux hamsters témoins. Les nombres à côté des astérisques indiquent la valeur p exacte. ns pour non significatif. Panneau (c) créé avec BioRender.com.

Nous avons ensuite injecté à des hamsters par voie intramusculaire un cocktail de MxR et de 3 × 1 au jour -2, co-infecté des hamsters avec HPIV3 et RSV au jour 0, et prélevé des poumons et des cornets nasaux au jour 5 après l'infection (Fig. 6c). Le cocktail d'anticorps n'a pas eu d'impact sur la réplication de HPIV3 dans les cornets nasaux mais a considérablement réduit la charge virale dans les poumons de plus de 88 fois (Fig. 6d). Le cocktail d'anticorps a spécifiquement réduit la charge virale du VRS dans les poumons et les cornets nasaux de plus de 17 fois et 2,9 fois, respectivement, et le VRS était inférieur à la limite de détection dans les poumons de quatre hamsters sur sept (Fig. 6e). À l'aide d'un test de plaque, le cocktail d'anticorps a réduit de manière significative la réplication virale combinée de HPIV3 et de RSV dans les poumons à des niveaux indétectables chez 6 animaux sur 7 et de plus de 6 fois dans les cornets nasaux (Fig. 6f).

Nous avons isolé deux anticorps monoclonaux antiviraux neutralisants croisés : 3 × 1 qui cible HPIV3 et HPIV1 ; et MxR qui cible le RSV et le HMPV. Combinés, ces deux anticorps pourraient fournir une protection simultanée et étendue contre quatre des principaux virus respiratoires qui affligent les patients transplantés de cellules souches hématopoïétiques et d'autres populations vulnérables. Pour cela, nous avons développé une stratégie d'appâtage et de commutation basée sur le raisonnement selon lequel les cellules B capables de se lier à un virus, tout en neutralisant un autre virus, sont plus susceptibles de neutraliser les deux virus. Cette stratégie a conduit à la découverte de 3 × 1, un anticorps monoclonal qui neutralise plusieurs virus parainfluenza. La stratégie d'appâtage et de commutation pourrait également être une approche généralement utile pour identifier les anticorps neutralisants croisés contre d'autres agents pathogènes dans une situation où tous les antigènes ne sont pas connus ou disponibles. Nous avons également utilisé l'enrichissement magnétique et le tri cellulaire pour isoler des cellules B rares qui pourraient se lier spécifiquement aux protéines de fusion recombinantes dans la conformation préF mais pas dans la conformation postF. En outre, nous avons exploité les cellules nourricières exprimant CD40L, IL2 et IL2127,62 pour stimuler la production d'anticorps à partir de cellules B individuelles en culture. Ensemble, ces techniques ont permis l'isolement et le criblage à haut débit des lymphocytes B pour la neutralisation croisée.

Le ciblage d'épitopes fonctionnellement conservés entre des virus homologues est une stratégie attrayante pour réduire le risque de développer une résistance aux médicaments en raison de l'émergence de mutations d'échappement ; et, en même temps, peut augmenter les avantages de la prophylaxie pré-exposition en protégeant contre un éventail plus large d'agents pathogènes. Le mAb 3 × 1 à neutralisation croisée se lie à un site sur HPIV3 preF, que nous avons appelé site X, situé entre l'équateur et l'apex, sur les sommets du trimère F de préfusion. Il est possible que 3 × 1 se lie au site de clivage de la furine de HPIV3, en particulier l'extrémité C-terminale de la protéine F2, bien que cette région soit trop désordonnée pour être modélisée efficacement. Les anticorps qui neutralisent de manière croisée les virus phylogénétiquement apparentés ont tendance à cibler des épitopes bien conservés63. L'interaction entre les saillies non polaires sur la chaîne lourde de 3 × 1 avec des rainures à la surface pourrait représenter un mécanisme permettant de se lier à la fois à HPIV3 et à HPIV1. De plus, la chaîne légère de 3 × 1 englobe une grande saillie sur HPIV3 preF et forme une liaison hydrogène sur Asp143, qui est conservée dans HPIV1. 3 × 1 lie probablement l'hélice HRA de HPIV3 et HPIV1, qui est un site qui subit un mouvement important pendant la fusion lorsque la protéine F passe de la conformation préF à la conformation postF. Une analyse structurale plus poussée sera nécessaire pour développer une meilleure compréhension des interactions moléculaires qui interviennent dans la neutralisation 3 × 1 de HPIV1.

Le mAb MxR neutralise à la fois le HMPV et le RSV et partage des similitudes notables avec un autre anticorps, MPE814,34, y compris une similitude de séquence significative qui conduit à des modes de liaison comparables. Cependant, MxR est un anticorps plus somatiquement hypermuté et facilite la reconnaissance du site III sans le CDRH3 étendu observé dans MPE8, ce qui pourrait fournir une reconnaissance de site plus favorable sur le plan énergétique. Cette différence structurelle peut être à la base de la différence observée entre MxR et MPE8 dans leur neutralisation du HMPV, MxR ayant une puissance environ 5,7 fois supérieure.

Le palivizumab est actuellement le seul anticorps approuvé par la FDA pour la prévention du VRS chez les nourrissons à haut risque. Cependant, étant donné que la protection offerte par le palivizumab est limitée au VRS, il n'a pas été largement utilisé chez les enfants ou les adultes immunodéprimés chez qui d'autres virus comme le HMPV, le HPIV3 et le HPIV1 contribuent de manière significative à la maladie64. Un cocktail de MxR et de 3×1 pourrait donc potentiellement répondre à ce besoin non satisfait d'un médicament plus largement protecteur. L'indication clinique de l'anticorps monoclonal D25 spécifique du VRS, qui est en cours de développement sous le nom de nirsevimab pour remplacer le palivizumab, est également axée sur les nourrissons33. Nous et d'autres avons observé une liaison réduite de D25 à la protéine préF du sous-type B du RSV par rapport au sous-type A du RSV [Fig. 3c ; aussi réf. 65]. Ceci est remarquable car des mutations d'échappement à D25 ont été identifiées chez des nourrissons qui ont subi une percée d'infection par le sous-type B du VRS après avoir reçu du nirsevimab32. RB1 est un autre anticorps en développement clinique avec une puissance égale contre le RSV-A et -B mais ne neutralise pas le HMPV35. L'anticorps MxR à neutralisation croisée que nous décrivons dans la présente étude se lie fortement aux protéines préF des sous-types A et B du RSV et neutralise également le HMPV. Une analyse des mutations d'échappement potentielles qui pourraient survenir cliniquement et de leur coût d'adaptation à la réplication virale est une prochaine étape importante dans le développement de MxR et 3 × 1.

Pour étudier l'utilité clinique potentielle de l'administration d'un cocktail de MxR et de 3 × 1 pour protéger contre le VRS, le HMPV, le HPIV3 et le HPIV1, nous avons concentré nos études d'efficacité in vivo sur l'immunoprophylaxie. L'importance de prévenir les infections virales respiratoires pour les populations vulnérables est devenue de plus en plus évidente pendant la pandémie de COVID-19. Un cocktail de deux anticorps monoclonaux spécifiques du SRAS-CoV-2 commercialisé sous le nom d'Evusheld a été autorisé par la FDA pour la prophylaxie chez les personnes immunodéprimées qui devraient présenter une mauvaise réponse à la vaccination. Dans un essai de phase III, Evusheld, administré par voie intramusculaire à raison de 600 mg d'anticorps totaux, a entraîné une réduction de 83 % du risque relatif de COVID-1966 symptomatique. En raison des mutations d'échappement présentes dans la variante omicron, la FDA a révisé la dose à 1200 mg d'anticorps totaux, ce qui, pour un individu de 60 kg, est une dose de 20 mg/kg. Dans nos études d'efficacité in vivo, nous avons de même administré un cocktail de deux anticorps MxR et 3 × 1, chacun à 5 mg/kg pour une dose totale de 10 mg/kg. Par conséquent, les doses testées dans la présente étude se situent dans la fourchette d'autres anticorps déjà utilisés en clinique, ce qui laisse de la place pour une augmentation des doses dans les futures études sur l'homme. Ensemble, MxR et 3 × 1 représentent des candidats mAb prometteurs pour un développement ultérieur afin de protéger contre un large éventail d'infections virales respiratoires chez les populations de patients très vulnérables.

Cette étude est conforme à toutes les réglementations éthiques pertinentes et a été examinée et approuvée par le Fred Hutchinson Cancer Center Institutional Review Board. Le sang périphérique a été obtenu par ponction veineuse auprès de volontaires adultes sains et séronégatifs pour le VIH inscrits dans l'étude Seattle Area Control après consentement éclairé (protocole n ° 5567). Les PBMC ont été isolés du sang total à l'aide du système Accuspin Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, cat # 10771). Les études impliquant des rates humaines ont été considérées comme des recherches sur des sujets non humains puisque les tissus ont été anonymisés. Les échantillons de rate ont été considérés comme des recherches sur des sujets non humains par le Fred Hutch Institutional Review Board et tels que définis par la règle commune de l'Office for Human Research Protections. Les tissus ont été anonymisés et provenaient de donneurs décédés chez lesquels la rate aurait autrement été jetée lors du prélèvement d'autres organes (c.-à-d. le foie) pour le don. Les fragments de tissu ont été passés à travers un tamis à panier, centrifugés à 300 × g pendant 7 min, incubés avec un tampon de lyse ACK (Thermo Fisher, cat # A1049201) pendant 3,5 min, remis en suspension dans du RPMI (Gibco, cat # 11875093), et passés à travers un tamis cellulaire empilé de 500 et 70 µm. Les cellules ont été remises en suspension dans du diméthylsulfoxyde à 10 % dans du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Gibco, cat # 16000044) et cryoconservées dans de l'azote liquide avant utilisation.

Des cellules 293F (Thermo Fisher, cat # R79007) ont été cultivées dans du milieu Freestyle 293 (Thermo Fisher, cat # 12338026). Des cellules Vero (ATCC CCL-81), des cellules LLC-MK2 (ATCC CCL-7.1) et HEp-2 (ATCC CCL-23) ont été cultivées dans du DMEM (Gibco, cat#12430054) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et de pénicilline 100 U/mL plus 100 μg/mL de streptomycine (Gibco, cat#15140122). Bien que HEp-2 soit une lignée cellulaire souvent mal identifiée en raison de la contamination des cellules HeLa (iclac.org/databases/cross-contaminations/), HEp-2 est traditionnellement utilisé pour faire pousser le RSV à des titres élevés.

Les virus recombinants RSV-GFP, HMPV-GFP, HPIV1-GFP et HPIV3-GFP ont été précédemment décrits46,67,68,69 et ont été modifiés, respectivement, à partir de la souche RSV A2 (numéro d'accès GenBank KT992094), HMPV CAN97-83 (numéro d'accès GenBank AY297749), HPIV1/Washington/20993/1964 (numéro d'accès GenBank AF4571 02) et HPIV3 JS (numéro d'accès GenBank Z11575) pour exprimer la GFP améliorée. La souche 18537 du sous-type B du RSV (numéro d'accès GenBank MG813995) a été obtenue auprès de l'ATCC (cat # VR-1580). La souche B1 du sous-type B du RSV (numéro d'accès GenBank AF013254.1) a été obtenue auprès de ViraTree (cat#RSVB-GFP3). HMPV, HPIV1 et HPIV3 ont été cultivés sur des cellules LLC-MK2 et le RSV a été cultivé sur des cellules HEp-2. Le virus a été purifié par centrifugation dans un gradient discontinu de 30 %/60 % de saccharose avec HEPES 0,05 M et MgSO4 0,1 M (Sigma-Aldrich, cat # H4034 et 230391, respectivement) à 120 000 × g pendant 90 min à 4 °C. Les titres de virus ont été déterminés en infectant des monocouches de cellules Vero dans des plaques à 24 puits avec des dilutions en série de 10 fois du virus, superposées avec du DMEM contenant 0, 8% de méthylcellulose (Sigma-Aldrich, cat # M0387). Pour les tests impliquant HPIV1 et HMPV, 1,2 % de 0,05 % de trypsine (Gibco, cat#25300054) a été inclus dans le milieu. Les plaques fluorescentes ont été comptées à l'aide d'un scanner Typhoon (GE Life Sciences) 5 jours après l'infection.

Les plasmides d'expression pour les antigènes préF et postF du RSV, du HMPV et du HPIV3 marqués par His sont décrits précédemment26,70,71. Les cellules 293F ont été transfectées à une densité de 106 cellules/mL dans du milieu Freestyle 293 en utilisant 1 mg/mL de PEI Max (Polysciences, cat#24765). Les cellules transfectées ont été cultivées pendant 7 jours sous agitation douce à 37°C. Le surnageant a été recueilli par centrifugation des cultures à 2500 xg pendant 30 minutes, suivie d'une filtration à travers un filtre de 0,2 uM. Le surnageant clarifié a été incubé avec des billes Ni Sepharose pendant une nuit à 4 ° C, suivi d'un lavage avec un tampon de lavage contenant du Tris 50 mM, du NaCl 300 mM et de l'imidazole 8 mM. La protéine marquée His a été éluée avec un tampon d'élution contenant du Tris 25 mM, du NaCl 150 mM et de l'imidazole 500 mM. La protéine purifiée a été passée sur une colonne d'exclusion de taille Superose 6 10/300 (GE Life Sciences, cat # 17–5172–01). Les fractions contenant les protéines F trimères ont été regroupées et concentrées par centrifugation dans une unité d'ultrafiltration Amicon de 50 kDa (Millipore, cat#UFC805024). L'échantillon concentré a été stocké dans du glycérol à 50 % à -20 °C.

Les antigènes F purifiés ont été biotinylés à l'aide d'un kit EZ-link Sulfo-NHS -LC-Biotinylation (Thermo Fisher, cat # A39257) avec un rapport molaire de 1: 1, 3 de biotine à F. La biotine non conjuguée a été éliminée par centrifugation à l'aide d'une colonne d'exclusion de taille Amicon Ultra de 50 kDa (Millipore). Pour déterminer le nombre moyen de molécules de biotine liées à chaque molécule de F, la streptavidine-PE (ProZyme, cat # PJRS25) a été titrée en une quantité fixe de F biotinylé à des concentrations croissantes et incubée à température ambiante pendant 30 min. Les échantillons ont été analysés sur un gel SDS – PAGE (Invitrogen, cat # NW04127BOX), transférés sur nitrocellulose et incubés avec de la streptavidine – Alexa Fluor 680 (Thermo Fisher, cat # S32358) à une dilution de 1: 10 000 pour déterminer le point auquel il y avait un excès de biotine disponible pour le réactif streptavidine – Alexa Fluor 680 à lier. Le F biotinylé a été mélangé avec de la streptavidine-allophycocyanine (APC) ou de la streptavidine-PE selon le rapport déterminé ci-dessus pour saturer complètement la streptavidine et incubé pendant 30 min à température ambiante. Le F non conjugué a été éliminé par centrifugation à l'aide d'un dispositif centrifuge Nanosep 300 K (Pall Corporation, cat # OD300C33). Les tétramères APC/DyLight755 et PE/DyLight650 ont été créés en mélangeant F avec de la streptavidine-APC pré-conjuguée avec DyLight755 (Thermo Fisher, cat#62279) ou de la streptavidine-PE pré-conjuguée avec DyLight650 (Thermo Fisher, cat#62266), respectivement, en suivant les instructions du fabricant. En moyenne, APC/DyLight755 et PE/DyLight650 contenaient 4 à 8 molécules de DyLight par APC et PE. La concentration de chaque tétramère a été calculée en mesurant l'absorbance d'APC (650 nm, coefficient d'extinction = 0,6 µM-1 cm-1) ou de PE (566 nm, coefficient d'extinction = 2,0 µM-1 cm-1).

1 à 2 × 108 PBMC congelés ou 4 à 8 × 107 cellules spléniques congelées ont été décongelés dans du DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal et 100 U/mL de pénicilline plus 100 µg/mL de streptomycine. Les cellules ont été centrifugées et remises en suspension dans 50 µL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) glacé composé de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et de sérum de veau nouveau-né à 1 % (Thermo Fisher, cat # 26010074). Des tétramères conjugués PostF APC/DyLight755 et PE/Dylight650 ont été ajoutés à une concentration finale de 25 nM en présence de 2 % de sérum de rat et de souris (Thermo Fisher) et incubés à température ambiante pendant 10 min. Les tétramères PreF APC et PE ont ensuite été ajoutés à une concentration finale de 5 nM et incubés sur de la glace pendant 25 min, suivis d'un lavage de 10 ml avec un tampon FACS glacé. Ensuite, 50 μL de microbilles conjuguées anti-APC (Miltenyi Biotec, cat # 130-090-855) et anti-PE (Miltenyi Biotec, cat # 130-048-801) ont été ajoutées et incubées sur de la glace pendant 30 min, après quoi 3 ml de tampon FACS ont été ajoutés et le mélange a été passé sur une colonne LS magnétisée (Miltenyi Biotec, cat #130-042-401). La colonne a été lavée une fois avec 5 ml de tampon FACS glacé, puis retirée du champ magnétique et 5 ml de tampon FACS glacé ont été poussés deux fois à travers la colonne non magnétisée à l'aide d'un piston pour éluer la fraction cellulaire liée.

Les cellules ont été incubées dans 50 μL de tampon FACS contenant un cocktail d'anticorps pendant 30 min sur de la glace avant lavage et analyse sur un FACS Aria (BD). Les anticorps comprenaient anti-IgM FITC (G20–127, BD, cat#555782, dilution 1:80), anti-CD19 BUV395 (SJ25C1, BD, cat#563551, dilution 1:20), anti-CD3 BV711 (UCHT1, BD, cat#563725, dilution 1:50), anti-CD14 BV711 (M 0P-9, BD, cat#563372, dilution 1:50), anti-CD16 BV711 (3G8, BD, cat#563127, dilution 1:50), anti-CD20 BUV737 (2H7, BD, cat#612849, dilution 1:20), anti-IgD BV605 (IA6–2, BD, cat#563313, 1 : 50), anti-CD27 PE/Cy7 (LG.7F9, eBioscience, cat#25-0271-82, dilution 1:160) et un colorant de viabilité fixable (Tonbo Biosciences, cat#13-0870-T500, dilution 1:250). Les cellules B ont été triées individuellement dans 1) des plaques PCR vides à 96 puits et immédiatement congelées, ou 2) des plaques à fond plat à 96 puits contenant des cellules nourricières qui avaient été ensemencées à une densité de 28 600 cellules/puits un jour avant dans 100 µL de milieu IMDM (Gibco, cat#31980030) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline plus 100 µg/mL de str eptomycine et 2,5 µg/mL d'amphotéricine. Les cellules B triées sur les cellules nourricières ont été cultivées à 37 ° C pendant 13 jours.

Pour les cellules B individuelles triées et congelées dans des plaques PCR vides à 96 puits, la transcription inverse (RT) a été effectuée directement après décongélation des plaques à l'aide de SuperScript IV (Thermo Fisher, cat#18090200)72,73. En bref, 3 µL de mélange réactionnel RT composé de 3 µL d'hexamères aléatoires 50 µM (Thermo Fisher, cat#48190011), 0,8 µL de désoxyribonucléotide triphosphates 25 mM (dNTP; Thermo Fisher, cat#N8080261), 1 µL (20 U) SuperScript IV RT, 0,5 µL (20 U) RNaseOUT (Thermo Fisher, cat#1 0777019), 0,6 µL d'Igepal à 10 % (Sigma-Aldrich, cat#I8896) et 15 µL d'eau sans RNase ont été ajoutés à chaque puits contenant une seule cellule B triée et incubés à 50 °C pendant 1 h. Pour les cellules B individuelles triées sur des cellules nourricières, le surnageant a été retiré après 13 jours de culture, les plaques ont été immédiatement congelées sur de la neige carbonique, stockées à -80 ° C, décongelées et l'ARN a été extrait à l'aide du RNeasy Micro Kit (Qiagen, cat # 74034). L'éluat entier de l'extraction d'ARN a été utilisé à la place de l'eau dans la réaction de RT. Après RT, 2 µL d'ADNc ont été ajoutés à 19 µL de mélange réactionnel PCR de sorte que la réaction finale contienne 0,2 µL (0,5 U) de polymérase HotStarTaq (Qiagen, cat#203607), 0,075 µL d'amorces inverses 50 µM 3′, 0,115 µL d'amorces sens 5′ 50 µM, 0,24 µL de 25 mM d NTP, 1,9 µL de tampon 10 × (Qiagen) et 16,5 µL d'eau. Le programme de PCR était de 50 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 57 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 55 s, suivis de 72 ° C pendant 10 min pour les chaînes lourdes et légères kappa. Le programme PCR était de 50 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 55 s, suivis de 72 ° C pendant 10 min pour les chaînes légères lambda. Après le premier tour de PCR, 2 µL du produit de PCR ont été ajoutés à 19 µL de la réaction de PCR du second tour de sorte que la réaction finale contienne 0,2 µL (0,5 U) de polymérase HotStarTaq, 0,075 µL d'amorces inverses 50 µM 3′, 0,075 µL d'amorces sens 5′ 50 µM, 0,24 µL de dNTP 25 mM, 1 0,9 µL de tampon 10 × et 16,5 µL d'eau. Les programmes de PCR étaient les mêmes que ceux du premier cycle de PCR. 4 μL du produit de PCR ont été passés sur un gel d'agarose pour confirmer la présence d'une bande de chaîne lourde d'environ 500 pb ou d'une bande de chaîne légère d'environ 450 pb. 5 μL des réactions PCR montrant la présence d'amplicons de chaînes lourdes ou légères ont été mélangés avec 2 μL d'ExoSAP-IT (Thermo Fisher, cat # 78201) et incubés à 37 ° C pendant 15 min suivis de 80 ° C pendant 15 min pour hydrolyser les amorces et les nucléotides en excès. Les produits de PCR de deuxième tour hydrolysés ont été séquencés par Genewiz avec l'amorce inverse respective utilisée dans la PCR de deuxième tour, et les séquences ont été analysées à l'aide d'IMGT/V-Quest pour identifier les segments de gènes V, D et J. Des séquences appariées de chaîne lourde VDJ et de chaîne légère VJ ont été clonées dans des vecteurs d'expression dérivés de pTT3 contenant les régions constantes humaines IgG1, IgK ou IgL en utilisant le clonage In-Fusion (Clontech, cat # 638911)74.

L'IgG sécrétoire a été produite en co-transfectant des cellules 293F à une densité de 106 cellules/mL avec les plasmides d'expression de chaîne lourde et légère appariés à un rapport de 1:1 dans du milieu Freestyle 293 en utilisant 1 mg/mL de PEI Max. Les cellules transfectées ont été cultivées pendant 7 jours sous agitation douce à 37°C. Le surnageant a été collecté par centrifugation des cultures à 2500 xg pendant 15 min suivie d'une filtration à travers un filtre de 0,2 uM. Les surnageants clarifiés ont ensuite été incubés avec de l'agarose de protéine A (Thermo Scientific, cat # 22812), puis lavés avec un tampon de liaison aux IgG (Thermo Scientific, cat # 21007). Les anticorps ont été élues avec un tampon d'élution IgG (Thermo Scientific, cat # 21004) dans un tampon de neutralisation contenant 1 M Tris-base pH 9,0. L'anticorps purifié a été concentré et le tampon a été échangé dans du PBS en utilisant une unité d'ultrafiltration Amicon avec un seuil de poids moléculaire de 50 kDa.

Fab a été produit en incubant 10 mg d'IgG avec 10 µg de LysC (New England Biolabs, cat # P8109S) pendant une nuit à 37 ° C, suivi d'une incubation avec la protéine A pendant 1 h à température ambiante. Le mélange a ensuite été centrifugé à travers un filtre PVDF, concentré dans du PBS avec une colonne d'exclusion de taille Amicon Ultra de 30 kDa et purifié davantage par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) à l'aide de Superdex 200 (GE Healthcare Life Sciences, cat# 17–5175–01) dans 5 mM HEPES et 150 mM NaCl.

Des essais d'interférométrie de couche biologique (BLI) ont été effectués sur l'instrument Octet.Red (ForteBio) à température ambiante avec agitation à 500 tr/min. Pour les analyses d'affinité apparente (KD), des capteurs de capture anti-penta His (ForteBio, cat#18–5120) ont été chargés dans un tampon cinétique (PBS avec 0,01 % d'albumine de sérum bovin, 0,02 % de Tween 20 et 0,005 % de NaN3, pH 7,4) contenant 0,5 µM de RSV-A, RSV-B, HMPV ou HPIV3 preF purifiés pendant 150 s . Après le chargement, le signal de base a été enregistré pendant 60 s dans un tampon cinétique. Les capteurs ont ensuite été immergés dans du tampon cinétique contenant 266,7, 133,3, 66,7, 33,3 ou 16,7 nM d'anticorps monoclonal purifié pendant une étape d'association de 300 s suivi d'une immersion dans du tampon cinétique pendant une phase de dissociation d'au moins 600 s. La réponse maximale a été déterminée en faisant la moyenne du décalage nanométrique sur les 5 dernières s de l'étape d'association après soustraction du signal de fond de chaque puits contenant l'analyte à l'aide d'un mAb témoin négatif à chaque instant. L'ajustement de la courbe a été effectué à l'aide d'un modèle de liaison 1: 1 et du logiciel d'analyse de données ForteBio Octet version 9.0. Pour les essais de liaison compétitive, des capteurs de capture anti-penta His ont été chargés dans un tampon cinétique contenant 1 µM de HPIV3 preF marqué His pendant 300 s. Après le chargement, le signal de base a été enregistré pendant 30 s dans un tampon cinétique. Les capteurs ont ensuite été immergés pendant 300 s dans un tampon cinétique contenant 40 µg/mL du premier anticorps suivi d'une immersion pendant 300 s supplémentaires dans un tampon cinétique contenant 40 µg/mL du second anticorps. Le pourcentage de compétition a été déterminé en divisant l'augmentation maximale du signal du second anticorps en présence du premier anticorps par le signal maximal du second anticorps seul.

Les cellules Vero ont été étalées dans des plaques à fond plat à 96 puits en double et cultivées pendant 48 h, puis incubées avec HPIV3 à un MOI = 0, 01 pendant une heure à 37 ° C. Les cellules ont été lavées cinq fois pour éliminer le virus non adsorbé. 3 × 1 (10 µg/mL) ou milieu (témoin) a été ajouté aux cellules. La propagation de cellule à cellule et la formation de syncytia ont été examinées aux jours 1, 3 et 5 après l'infection à l'aide d'un système d'imagerie cellulaire EVOS (Thermo Fisher).

Pour le criblage de neutralisation des surnageants de culture, des cellules Vero ont été ensemencées dans des plaques à fond plat à 96 puits et cultivées pendant 48 h. Après 13 jours de culture, 40 µL de surnageant de culture de cellules B ont été mélangés avec 25 µL de GFP-HPIV1 purifié au saccharose dilué à 2000 unités formant plaque (pfu)/mL pendant 1 h à 37 °C. Les cellules Vero ont ensuite été incubées avec 50 µL du mélange surnageant/virus pendant 1 h à 37 °C pour permettre l'adsorption virale. Ensuite, chaque puits a été recouvert de 100 µL de DMEM contenant 0,8 % de méthylcellulose et 1,2 % de 0,05 % de trypsine. Les plaques fluorescentes ont été comptées 5 jours après l'infection à l'aide d'un imageur Typhoon.

Les titres neutralisants d'anticorps monoclonaux ont été déterminés par un test de neutralisation par réduction de plaque à 60 % (PRNT60). Les cellules Vero ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits et cultivées pendant 48 h. Les anticorps monoclonaux ont été dilués en série 1:4 dans 120 µL de DMEM et mélangés avec 120 µL de RSV, HMPV, HPIV3 ou HPIV1 purifiés au saccharose dilués à 2000 pfu/mL pendant une heure à 37 °C. Les cellules Vero ont été incubées avec 100 µL du mélange anticorps/virus pendant 1 h à 37 °C pour permettre l'adsorption virale. Chaque puits a ensuite été recouvert de 500 µL de DMEM contenant 0,8 % de méthylcellulose. Les plaques fluorescentes ont été comptées 5 jours après l'infection à l'aide d'un imageur Typhoon. Les titres PRNT60 ont été calculés par analyse de régression linéaire (http://exon.niaid.nih.gov/plaquereduction/).

1,47 mg de RSV preF avec 1,45 mg de MxR Fab ont été mélangés et incubés pendant une nuit à 4 ° C avec une légère oscillation, avant purification SEC sur une colonne Superose 6 10/300 (Cytiva, cat # 29091596). Un pic très large s'est élué, avec les neuf plus grandes fractions concentrées à 0,22 mg/mL à l'aide d'une unité d'ultrafiltration Amicon à seuil de 10 kDa (Sigma-Aldrich, cat#UFC8030). Pour 3 × 1, nous avons incubé 50 µg de HPIV3 preF avec 150 µg de 3 × 1 Fab pendant une nuit à 4 ° C avec une légère oscillation avant purification SEC sur une colonne Superdex 200 16/600 SEC (Cytiva, cat # 28989335). Un seul pic étroit de poids moléculaire élevé a été élue et a été concentré à 0,4 mg/mL en utilisant une unité d'ultrafiltration Amicon avec un seuil de coupure de 10 kDa.

Les deux complexes ont été congelés sur des grilles Quantifoil 1.2/1.3 UltrAu 300 mesh (Electron Microscopy Sciences, cat#Q350AR13A) à l'aide d'un Vitrobot Mk. IV (Thermo Fisher) à 22 °C et 100 % d'humidité. Du dodécyl-β-d-maltoside (DDM) a été ajouté à l'échantillon (concentration finale de 0,05 %) 30 min avant le début de la congélation, et un PELCO easiGlow™ (Tedpella, Cat#91000) a été utilisé pour décharger les grilles. Les grilles finales MxR:RSV utilisées pour la collecte ont été congelées avec 4 µL de l'échantillon à 0,21 mg/mL, un temps de transfert de 14 s, une force de transfert de 0 et une attente de 5 s entre l'application et le transfert. Les grilles finales 3 × 1:HPIV3 utilisées pour la collecte ont été congelées avec 4 µL de l'échantillon à 0,19 mg/mL, un temps de transfert de 12 s, une force de transfert de 0 et une attente de 15 s entre l'application et le transfert.

Les ensembles de données ont été collectés sur un microscope cryo-électronique Titan Krios G3 (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à 300 kV avec un K3 DED (Gatan Inc.) au Pacific Northwest Center for Cryo-EM (PNCC). Les données ont été collectées dans des films de 50 images à l'aide de Serial EM à un grossissement ×92 000 (0,514425 Å/px en mode super-résolution). Les deux collections ont duré 24 h, produisant 6282 films pour 3 × 1:HPIV3 et 5796 films pour MxR:RSV. 3 × 1:HPIV3 a été collecté avec une inclinaison de 30° en raison de l'orientation préférée observée lors du dépistage.

Les ensembles de données ont été traités à l'aide de cryoSPARC v3.3.175. Après l'importation, la correction du mouvement du patch (micrographies regroupées à 1,02885 Å/px) et l'estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF), les micrographies ont été organisées pour un ajustement <4 Å CTF. Le sélecteur de gouttes a été utilisé pour sélectionner environ 50 000 particules, qui ont subi une classification 2D pour produire des modèles pour la sélection basée sur des modèles. Ces sélections ont été inspectées, conservées et extraites (taille de boîte de 192 pixels à 2,0577 Å/px) avec 1,49 million de particules pour MxR:RSV et 2,02 millions de particules pour 3 × 1:HPIV3.

Après deux cycles de classification 2D, 100 classes chacun, il nous restait 377 982 particules MxR:RSV montrant trois Fab liés. Un seul modèle ab initio a été généré et affiné. Les particules ont été réextraites à 1,02885 Å/px et soumises à un raffinement CTF local et à un raffinement non uniforme avec une symétrie C3. Suite à cela, les particules ont été davantage conservées et réextraites à l'aide de la correction de mouvement local, produisant 354 958 particules. Un raffinement non uniforme avec un masque personnalisé recadrant la région CH1 et le domaine GCN4 a produit une carte affinée (GSFSC = 0,143) de résolution de 2,41 Å en utilisant la symétrie C1 et de 2,24 Å en utilisant la symétrie C3.

La génération de modèles pour 3 × 1: HPIV3 a produit un mélange de classes avec un, deux ou trois Fab liés, qui ont tous été utilisés pour la sélection de modèles d'origine. Nous avons effectué un cycle de classification 2D avec 100 classes, en sélectionnant des particules solitaires qui montraient n'importe quel nombre de Fab liés, produisant une pile de 1,3 million de particules. La modélisation ab-initio a produit une carte unique avec un Fab lié à HPIV3 preF, et un raffinement ultérieur a produit une carte avec une résolution GSFSC de 3, 7 Å aux seuils de 0, 143 en utilisant la symétrie C1. Une carte supplémentaire de trois Fab a été produite avec une symétrie C3 dans un raffinement non uniforme à 4, 3 Å, bien qu'en raison de la faible résolution, cette carte n'ait pas été utilisée dans la construction de modèles. Des améliorations mineures ont été apportées en effectuant un raffinement homogène C3, suivi d'une expansion de symétrie C3, d'une classification 3D avec quatre classes et de la suppression des particules en double de la classe la plus homologue, produisant une pile de 1,04 million de particules. Les particules ont été ré-extraites avec le travail de correction de mouvement local, regroupées à 1,02885 Å/px, et la carte a été affinée à l'aide du raffinement non uniforme C1. Cela a produit notre carte nette finale avec une résolution de 3,62 Å (GSFSC = 0,143).

Les deux cartes finales ont ensuite été traitées à l'aide de l'ordinateur COSMIC276 avec le module DeepEMhancer77. Les cartes DeepEM améliorées et cryoSPARC ont été utilisées pour ajuster les structures de MxR:RSV et 3 × 1:HPIV3 à la carte. Le raffinement et la validation de la structure ont été effectués dans la suite logicielle Phenix78 et Coot79. Un raffinement supplémentaire a été effectué dans ChimeraX80 en utilisant le plugin ISOLDE81 si nécessaire. Les demi-cartes non masquées, les cartes affinées et les masques utilisés ont été déposés à la PDB et à l'EMDB. Tous les graphiques ont été produits en Pymol82. Les graphiques ont été préparés à l'aide de GraphPad Prism 9. L'analyse de la surface enterrée a été effectuée à l'aide du serveur PDBePISA83.

Toutes les procédures ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Fred Hutch et menées conformément aux directives institutionnelles et nationales des instituts de santé. Des hamsters syriens dorés (Mesocricetus auratus) ont été infectés par voie intranasale avec 100 µL de 105 pfu RSV, HMPV, HPIV3 ou HPIV1. La taille des échantillons (globalement n = 24 pour les expériences de concentration d'anticorps sériques, n = 96 pour les expériences d'infection unique et n = 24 pour les expériences de co-infection) était cohérente avec les expériences précédemment publiées testant l'efficacité des anticorps monoclonaux du VRS dans le modèle de rat de coton58,59,84,85. Seuls les animaux mâles (âgés de 4 à 8 semaines) ont été évalués dans ce travail, car aucune association entre le sexe et les résultats cliniques n'a été observée chez les adultes atteints de RSV, HMPV, HPIV3 ou HPIV186,87. L'anticorps monoclonal a été administré par voie intramusculaire à 5, 2,5 ou 1,25 mg/kg dans 50 µL de PBS 2 jours avant l'infection. Pour le modèle de co-infection, 105 pfu de chaque virus ont été mélangés dans 100 µL de 1 × DPBS, et 5 mg/kg de chaque anticorps monoclonal ont été mélangés dans 50 µL de 1 × DPBS. Les cornets nasaux et les poumons ont été prélevés pour le titrage viral par dosage sur plaque 5 jours après l'infection et clarifiés par centrifugation dans du DMEM. Des monocouches de cellules Vero confluentes ont été inoculées en double avec des homogénats dilués dans des plaques à 24 puits. Après incubation pendant 1 h à 37 ° C, les puits ont été recouverts de 0, 8% de méthylcellulose (fait avec 1, 2% de 0, 05% de trypsine pour les échantillons d'animaux provoqués avec HMPV et HPIV1). Après 5 jours, les plaques ont été comptées en utilisant l'imageur Typhoon pour déterminer les titres en pfu par gramme de tissu. Des aliquotes d'échantillons de cornet nasal et de poumon ont également été conservées pour la quantification de la charge virale par PCR en temps réel.

Les concentrations sériques de MxR et 3 × 1 ont été mesurées par ELISA. En bref, des plaques Nunc maxsorp à 96 puits (Thermo Fisher, cat # 442404) ont été recouvertes de 100 ng de Fab anti-humain de chèvre (Jackson ImmunoResearch, cat # 109-005-097) pendant 90 min à 4 ° C. Les puits ont été lavés trois fois avec 1 x DPBS puis incubés avec 1 x DPBS contenant 1 % d'albumine de sérum bovin (Sigma-Aldrich, cat # A2153) pendant 1 h à température ambiante. Les plaques recouvertes d'antigène ont été incubées avec du sérum pendant 90 min à 4 ° C. Une courbe standard a été générée avec des dilutions en série de 2 de palivizumab. Les puits ont été lavés trois fois avec 1 x DPBS, suivis d'une incubation d'une heure avec des Ig totales anti-humaines de chèvre conjuguées à la peroxydase de raifort à une dilution de 1: 6000 (Invitrogen, cat # 31412). Les puits ont ensuite été lavés quatre fois avec 1 × DPBS suivi d'une incubation de 5 à 15 minutes avec un substrat TMB (SeraCare, cat # 5120-0053). L'absorbance a été mesurée à 405 nm à l'aide d'un lecteur de plaques Softmax Pro (Molecular Devices). La concentration d'anticorps dans chaque échantillon a été déterminée par référence à la courbe standard et au facteur de dilution.

L'ARN viral a été extrait de 140 μL d'homogénat d'échantillon à l'aide du mini kit QIAamp vRNA (Qiagen, cat # 52904). L'ARN a été élué avec 50 µL d'eau et 11 µL de l'éluat ont été utilisés pour la transcription inverse. Des amorces de transcription inverse personnalisées pour RSV (5'-TCCAGCAAATACACCATCCAAC-3') et HPIV3 (5'-CTAGAAGGTCAAGAAAAGGGAACTC-3') ont été conçues pour se lier spécifiquement aux génomes de RSV et HPIV3, respectivement. Un microlitre de chaque amorce à 2 µM a été inclus dans un mélange réactionnel RT contenant 1 µL de RNaseOut, 1 µL de DTT 0,1 M, 4 µL de tampon SuperScript IV et 1 µL de transcriptase inverse SuperScript IV (Thermo Fisher, cat#18090200). La transcription inverse a été réalisée avec le cycle suivant : 42 °C pendant 10 min, 20 °C pendant 10 min, 50 °C pendant 10 min et 80 °C pendant 10 min. Des tests d'expression génique TaqMan personnalisés ont été développés pour le RSV (amorce directe 5'-TGACTCTCCTGATTGTGGGATGATA-3', amorce inverse 5'-CGGCTGTAAGACCAGATCTGT-3' et rapporteur 5'-CCCCTGCTGCTAATTT-3') et HPIV3 (amorce directe, 5'-CGGTGACACAGTGGATCAGATT-3', amorce inverse 5'-TGTTTCAACCATAAGAGTTACC AAGCT-3' et rapporteur 5'-ACCGCATGATTGACCC-3'). La réaction PCR consistait en 2,5 µL de ces amorces, 10 µL de la réaction de transcription inverse, 25 µL de TaqMan Universal Master Mix II avec UNG (Thermo Fisher, cat#4440038) et 12,5 µL d'eau. La PCR en temps réel a été réalisée à l'aide du système de PCR en temps réel QuantStudio 7 Flex avec les paramètres suivants : 50 °C pendant 2 min et 95 °C pendant 10 min suivis de 40 cycles à 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min. Pour générer une courbe standard, l'ARN viral a été extrait de stocks viraux purifiés au saccharose de RSV avec des titres connus en pfu/mL. La transcription inverse a été effectuée comme ci-dessus. La réaction de transcription inverse a été diluée en série huit fois à 1:4 dans de l'eau. La PCR en temps réel a été réalisée comme ci-dessus et des courbes standard ont été générées pour interpoler les charges virales en pfu/g à l'aide du logiciel de PCR en temps réel QuantStudio v1.0.

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de GraphPad Prism 7. Des comparaisons statistiques par paires ont été effectuées à l'aide de tests bilatéraux de Mann – Whitney. p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Les points de données des échantillons individuels sont affichés.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données de séquençage et structurelles qui appuient les résultats de cette étude ont été déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB) et la banque de données de microscopie électronique (EMDB) et sont accessibles via les numéros d'accès PDB 8DG8 (EMDB 27418) pour 3 × 1/HPIV3 et PDB 8DG9 (EMDB 27419) pour MxR/RSV. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Julie McElrath pour les PBMC de la cohorte Seattle Area Control ; Leo Stamatatos pour l'utilisation de l'espace et de l'équipement du laboratoire ; Andrew McGuire pour avoir fourni des cellules 3T3 exprimant CD40L/IL2/IL21 ; Ramasamy Bakthavatsalam et LifeCenter Northwest pour avoir fourni des restes de rate anonymisés ; Ursula Buchholz, Shirin Munir et Peter Collins pour avoir fourni le RSV, le HMPV, le HPIV3 et le HPIV1 exprimant la GFP ; Peter Kwong, Guillaume Stewart-Jones et Aliaksandr Druz pour l'expression de HPIV3 preF ; Barney Graham pour l'expression de RSV preF; Theodore Jardetzky et Xiaolin Wen pour l'expression de HMPV preF ; Steve Voght pour la relecture du manuscrit ; Paula Culver, Francesca Urselli et Laura Yates pour le soutien administratif ; les ressources partagées Fred Hutchinson Flow Cytometry pour l'assistance avec les instruments ; le Fred Hutchinson Comparative Medicine Shared Resources pour l'aide au logement des hamsters ; et les membres du Taylor Lab et du Boonyaratanakornkit Lab pour des discussions utiles. Des schémas expérimentaux ont été créés avec BioRender.com. Cette étude a été soutenue par la Vaccine and Infectious Disease Division Faculty Initiative (JB et JJT) et Evergreen Beyond Pilot Award (JB et JJT) du Fred Hutchinson Cancer Center, un accord de recherche sponsorisé avec IgM Biosciences (JB et JJT), un New Investigator Award de l'American Society for Transplantation and Cellular Therapy (JB) et le Amy Strelzer Manasevit Award du National Marrow Donor Program (JB). Une partie de cette recherche a été soutenue par U24 GM129547 du NIH et effectuée au PNCC de l'OHSU et accessible via EMSL (grid.436923.9), une installation utilisateur du DOE Office of Science parrainée par le Bureau de la recherche biologique et environnementale. D'autres données de microscopie électronique ont été générées à l'aide de la ressource partagée de microscopie électronique du Fred Hutchinson Cancer Center, qui est prise en charge en partie par P30 CA015704. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Madelyn Cabán, Justas V. Rodarte, Madeleine Bibby.

Division des vaccins et des maladies infectieuses, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, États-Unis

Madelyn Cabán, Justas V. Rodarte, Madeleine Bibby, Matthew D. Gray, Justin J. Taylor, Marie Pancera et Jim Boonyaratanakornkit

Département d'immunologie et Département de santé mondiale, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Madelyn Caban et Justin J. Taylor

Département de médecine, Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis

Jim Boonyaratanakornkit

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MC et MB ont conçu et mené les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. MDG a mené des expériences, analysé des données et édité le manuscrit. JVR et MP ont coordonné et effectué l'analyse structurelle et rédigé le manuscrit. JJT a conçu l'étude, conçu des expériences, analysé les données et édité le manuscrit. JB a conçu l'étude, conçu et mené les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit.

Correspondance avec Justin J. Taylor, Marie Pancera ou Jim Boonyaratanakornkit.

Les auteurs JB et JJT sont les inventeurs des demandes de brevets déposées par le Fred Hutchinson Cancer Center portant sur les anticorps 3×1 et MxR. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Yaroslav Tsybovsky et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Cabán, M., Rodarte, JV, Bibby, M. et al. Anticorps à protection croisée contre les virus respiratoires endémiques courants. Nat Commun 14, 798 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

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Reçu : 27 juin 2022

Accepté : 01 février 2023

Publié: 13 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

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