Un régulateur de pression miniaturisé imprimé en 3D (µPR) pour les applications de culture cellulaire microfluidique

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 10769 (2022) Citer cet article

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Des flux de fluides bien définis sont la caractéristique principale des systèmes de culture microfluidique et permettent un contrôle précis des signaux biophysiques et biochimiques à l'échelle cellulaire. Le contrôle du débit microfluidique est généralement réalisé à l'aide de techniques basées sur le déplacement (par exemple, des pompes à seringue ou péristaltiques) ou à pression contrôlée qui offrent de nombreuses options de perfusion, y compris des débits constants, en rampe et pulsés. Cependant, il peut être difficile d'intégrer ces dispositifs à grand facteur de forme et les périphériques qui les accompagnent dans des incubateurs ou d'autres environnements confinés. De plus, les études de culture microfluidique sont principalement réalisées dans des conditions de perfusion constante et les capacités de flux plus complexes sont souvent inutilisées. Ainsi, il existe un besoin pour une plate-forme de contrôle de flux simplifiée qui offre des capacités de perfusion standard et peut être facilement intégrée dans des environnements incubés. À cette fin, nous introduisons un micro-régulateur de pression (µPR) imprimé en 3D accordable et montrons qu'il peut fournir des capacités de contrôle de débit robustes lorsqu'il est combiné avec une pompe à air miniature alimentée par batterie pour prendre en charge les applications microfluidiques. Nous détaillons la conception et la fabrication du µPR et : (i) démontrons une plage de pression de sortie réglable pertinente pour les applications microfluidiques (1 à 10 kPa), (ii) mettons en évidence les capacités de contrôle dynamique dans un réseau microfluidique, (iii) et maintenons les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) dans un dispositif de culture à plusieurs compartiments dans des conditions de perfusion continue. Nous prévoyons que notre approche de fabrication imprimée en 3D et nos conceptions en libre accès permettront des µPR personnalisés pouvant prendre en charge une large gamme d'applications microfluidiques.

Les approches microfluidiques tirent parti de la manipulation précise des fluides pour introduire des capacités expérimentales uniques dans les applications biologiques1,2,3, y compris la stimulation biophysique définie des cellules cultivées4,5,6,7,8, l'afflux contrôlé de composés chimiques9,10,11 et l'introduction de populations de cellules secondaires dans l'environnement de culture12,13. Dans ces systèmes, le contrôle du débit de fluide est généralement réalisé via des schémas de pompage basés sur le déplacement ou pneumatiques14,15,16. Par exemple, les pompes à seringue utilisent le mouvement rotatif de vis mécaniques pour distribuer le fluide d'un corps de seringue à un débit contrôlé (Q), tandis que les pompes péristaltiques utilisent un mécanisme à came pour pousser ou tirer des fluides à travers des tubes conformes pour contrôler directement Q17. Bien que les pompes à seringue et péristaltiques soient fréquemment utilisées en raison de leurs solides capacités de contrôle du débit et de leur compatibilité avec les composants standardisés (par exemple, les seringues, les raccords et les tubes), elles peuvent être difficiles à intégrer dans des environnements confinés18. De plus, les oscillations mécaniques du mécanisme à vis ou à came peuvent introduire des pulsations d'écoulement indésirables qui entraînent des dommages cellulaires19,20,21,22.

En revanche, les schémas de pompage pneumatique créent une chute de pression définie (ΔP) à travers les réseaux microfluidiques pour contrôler Q. Pour ces flux entraînés par la pression, Q est défini par l'équation de Hagen-Poiseuille, Q = ΔPR−1, qui peut être considérée comme l'analogie hydraulique avec la loi d'Ohm, où R est la résistance fluidique définie par la géométrie du réseau et la viscosité du fluide23. En raison de la nature d'amortissement intrinsèque des systèmes pneumatiques, ces approches sont moins sensibles aux pulsations d'écoulement par rapport aux méthodes basées sur le déplacement18. Cependant, en raison des changements potentiels de résistance fluidique et des effets de contre-pression concomitants, les approches pneumatiques nécessitent souvent des équipements périphériques complexes, tels qu'une source d'air haute pression dédiée (par exemple, l'air de laboratoire), un contrôleur de pression en boucle fermée, des régulateurs de contre-pression et des capteurs de pression/débit en ligne pour maintenir un débit souhaité24,25,26. Par conséquent, les méthodes pneumatiques peuvent également être difficiles à intégrer dans des environnements de culture cellulaire confinés27.

Les techniques de déplacement et pneumatiques offrent toutes deux d'excellentes capacités de contrôle du débit et peuvent être programmées pour ajuster dynamiquement les profils de débit, y compris les débits progressifs, périodiques, pulsés ou même inversés. Cependant, ces fonctionnalités avancées sont souvent inutilisées dans les applications microfluidiques standard où un débit constant est utilisé pour perfuser ou stimuler le cisaillement des cellules cultivées28,29. La popularité expérimentale du débit de perfusion constant et contrôlé nous permet de donner la priorité à une solution de pompage simple et portable plutôt qu'à une solution dotée de fonctionnalités de débit avancées et d'une instrumentation complexe. Des approches alternatives pour simplifier le processus de pompage ont également été largement explorées. Par exemple, une pompe à perfusion commerciale iPrecio rechargeable à paume a été utilisée pour maintenir les cellules en culture30. Cependant, la pompe était coûteuse, à usage unique et ne pouvait pas être personnalisée. Alternativement, le pompage passif, y compris les méthodes hydrostatiques et basées sur la tension superficielle, est peu coûteux et facile à utiliser mais manque de stabilité à long terme, ce qui les rend inadaptés aux applications de culture microfluidique (> 24 h)31,32,33. Des approches de systèmes microélectromécaniques (MEMS) ont également été utilisées pour créer des pompes microfabriquées34,35. Bien que ces micropompes puissent fournir le contrôle à long terme requis pour les applications de laboratoire sur puce, la complexité des procédures de fabrication peut rendre la personnalisation et la mise en œuvre peu pratiques.

L'impression 3D, une technologie de fabrication additive émergente, a été adoptée comme méthode de fabrication pour les dispositifs de contrôle de flux microfluidiques hautement personnalisés en raison de capacités de prototypage rapide, de faibles coûts d'accès par rapport au fraisage CNC multi-axes et de faibles coûts d'outillage par rapport au moulage par injection36,37,38,39. L'impression 3D simplifie les processus de fabrication pour les caractéristiques difficiles à créer (par exemple, les contre-dépouilles, les caractéristiques autonomes et les cavités à rapport d'aspect élevé) à l'aide de technologies d'usinage conventionnelles ou de processus MEMS. Les chercheurs ont réussi à créer des composants imprimés en 3D pour les régulateurs de contre-pression40, les microvalves de type Quake41 et les dispositifs de commande de débit pneumatique26,42,43,44.

Pour répondre au besoin d'une plate-forme de pompage simple mais fonctionnelle, nous introduisons une plate-forme de pompage pneumatique qui utilise un régulateur de pression micro imprimé en 3D (µPR) pour fournir un ∆P accordable et contrôler le débit dans un réseau de canaux microfluidiques. Notre µPR utilise un mécanisme d'équilibre des forces pour réduire la pression fournie par une pompe à air alimentée par batterie à une plage de pression contrôlable pertinente pour les applications microfluidiques. Dans ce travail, nous détaillons la conception et la fabrication du μPR, établissons des caractéristiques dynamiques de contrôle et de stabilité de la pression et démontrons une culture réussie dans un modèle de barrière microfluidique compartimentée à base de membrane45,46. Comme les imprimantes 3D sont devenues largement accessibles dans les laboratoires de recherche et les espaces de création communautaires47,48, nous prévoyons que nos µPR imprimés en 3D, avec des conceptions en libre accès, peuvent être fabriqués et assemblés dans n'importe quel laboratoire et adaptés pour répondre aux exigences de flux spécifiques à l'application.

Les composants structurels du µPR, y compris les chambres d'entrée (haute pression) et de sortie (basse pression) et le composant de contrôle de la pression, ont été imprimés en 3D à l'aide de l'imprimante stéréolithographique Formlabs Form 2 (Formlabs Inc., Somerville, MA, USA). La résine Dental SG (Formlabs Inc., Somerville, MA, USA) a été choisie comme matériau de construction en raison de ses caractéristiques imperméables aux gaz et de sa biocompatibilité de classe I (EN-ISO 10993-1:2009/AC:2010). Les pièces imprimées en 3D ont été retirées de la plate-forme d'impression, rincées dans de l'alcool isopropylique à 99 %, séchées sous air sous pression et durcies aux UV pendant 45 min à 45 °C (FormCure, Formlabs Inc., Somerville, MA, USA), conformément aux recommandations du fabricant.

Un joint torique en fluoroélastomère Viton de taille 001 (shore 60A) (McMaster Carr, Elmhurst, IL, États-Unis) a été installé sur la bielle adjacente à la soupape à clapet de la chambre d'entrée haute pression, comme illustré à la Fig. 1a (i). Un joint torique en caoutchouc naturel de 8 mm de diamètre intérieur/10 mm de diamètre extérieur (shore 70A) (McMaster Carr, Elmhurst, IL, États-Unis) a ensuite été placé dans la rainure extérieure de la chambre d'entrée. La chambre de sortie basse pression, représentée sur la figure 1a (ii), a été placée au-dessus de la chambre d'entrée avec la bielle s'étendant à travers la cavité pour former le passage d'air à travers la chambre. Ensuite, un Kapton de 100 µm d'épaisseur (Gizmo Dorks LLC, Temple City, Californie, États-Unis) a été placé sur la chambre de sortie en tant que diaphragme de détection de pression, en contact avec la bielle. Comme le montre la figure 1a (iii), un joint torique a été placé sur le dessus du diaphragme pour aider à sceller le haut de la chambre de sortie. Le composant de contrôle de la pression avec des ressorts en porte-à-faux intégrés a ensuite été empilé sur le diaphragme. Ces porte-à-faux mesuraient 0,5 mm de large, 0,5 mm d'épaisseur et 5 mm de long. Un écrou M2 (McMaster Carr, Elmhurst, Illinois, États-Unis) a été collé aux ressorts en porte-à-faux avec un adhésif époxy (ClearWeld™ Professional, JB Weld Company, Sulphur Springs, Texas, États-Unis) (Fig. 1a(iv)). Comme le montre la Fig. 1(v), un boulon M2 a été vissé dans l'écrou. Un pointeur imprimé en 3D a été ajouté à la tête à six pans creux pour créer le bouton de commande. Un cadran en acrylique découpé au laser à 24 positions a été fixé au composant de contrôle de la pression à l'aide d'un adhésif sensible à la pression (PSA, 3M 468MP Adhesive Transfer Tape, 3M Company, Maplewood, MN, USA). Le cadran fournissait des indications pour les positions de rotation par incréments de 15˚. Enfin, des pinces imprimées en 3D ont été utilisées pour comprimer les joints toriques externes pris en sandwich entre les composants structurels et terminer l'assemblage, comme illustré à la Fig. 1a (vi). Le dispositif assemblé mesure 12 mm de diamètre et 20 mm de hauteur. La figure 1b montre une image de l'appareil assemblé à côté d'un centime américain pour l'échelle. Voir la vidéo supplémentaire S1 qui montre le processus d'assemblage.

(a) Vue schématique du flux de travail µPR et fabrication imprimé en 3D. (i) La chambre d'admission d'air haute pression comprend une soupape champignon, un joint torique d'étanchéité (blanc) et une bielle. (ii) La chambre à air basse pression est placée au-dessus de la chambre d'admission. (iii) Un diaphragme Kapton (jaune) et un joint torique (noir) sont placés au-dessus de la chambre de sortie. (iv) Le composant de contrôle de la pression, composé de trois porte-à-faux intégrés et d'un écrou fileté, est positionné au-dessus du joint torique. (v) Un boulon M2 avec un pointeur d'indication de position imprimé en 3D est vissé dans l'écrou. (vi) Le dispositif est ensuite scellé à l'aide de deux pinces de compression imprimées en 3D pour obtenir un assemblage étanche à l'air (Φ12 mm × 20 mm) et un cadran de position découpé au laser est ajouté. (b) Image du µPR imprimé en 3D assemblé à côté d'un sou des États-Unis pour l'échelle.

Des microcanaux de (poly)diméthylsiloxane (PDMS, Sylgard 184, Dow Inc., Midland, MI, USA) ont été fabriqués en utilisant des techniques de lithographie douce standard49,50. Le SU-8 2100 (Kayaku Advanced Materials, Westborough, MA, USA) a été appliqué par centrifugation sur une plaquette de silicium de 4″, cuit doucement, exposé à la lumière UV à travers un masque de transparence (CAD/Arts Services Inc., Bandon, OR, USA) pour définir les caractéristiques du canal et post-cuit à 95 °C. La résine photosensible a ensuite été développée (Kayaku Advanced Materials, Westborough, MA, USA). Un cadre rectangulaire en PMMA avec des régions ouvertes de longueur = 75 mm et largeur = 25 mm a été fixé à la plaquette à l'aide de PSA pour créer une cavité de moulage avec une hauteur définie. Après la fixation du cadre en PMMA, le moule a ensuite été rempli de prépolymère PDMS dégazé (rapport base sur catalyseur de 10: 1 en masse) et durci sur une plaque chauffante pendant 1 h à 80 ° C. Le bloc PDMS a ensuite été retiré du moule et les ports d'accès ont été évidés avec un poinçon de biopsie de 1 mm (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA).

Une simulation 3D a été réalisée à l'aide du module de physique des flux laminaires (stationnaire) de COMSOL Multiphysics. La géométrie des microcanaux (hauteur de 20 µm, largeur de 100 µm et longueur de 32 cm) a été appliquée avec le matériau défini comme de l'eau. Nous avons attribué des pressions (P = 1 à 10 kPa) à l'entrée de la géométrie du microcanal, tandis que la pression de sortie a été définie comme atmosphérique (P = 0) avec un reflux supprimé. Les autres côtés du bloc ont reçu des conditions aux limites sans glissement.

La configuration expérimentale générale comportait un µPR et une résistance de flux microfluidique PDMS (hauteur de 20 µm, largeur de 100 µm et longueur de 32 cm). Nous avons fourni la pression au µPR avec une pompe à air DC miniature SX-2 (Binaca Pumps, Temecula, CA, USA) fonctionnant à 3 V et 0,09 A. La sortie du µPR était connectée à un connecteur à trois voies, une extrémité alimentant l'entrée du canal microfluidique PDMS et l'autre connectée à un capteur de pression Honeywell (TBPDANS005PGUCV, Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA). Des tubes en silicone (ID de 2 mm, longueur de 5 cm) ont été utilisés pour connecter ces composants. Le microcanal PDMS a été amorcé avec une solution de colorant bleu (McCormick Inc., Baltimore, MD, USA) dans de l'eau déminéralisée pour améliorer le contraste.

La configuration expérimentale susmentionnée a permis la caractérisation de Pout en fonction de la position angulaire du bouton de commande. Le bouton de commande a été tourné par incréments de 15º (indiqué par le cadran en acrylique) pendant que Pout était surveillé. Pout a ensuite été autorisé à se stabiliser pendant 5 minutes à chaque position après avoir tourné le bouton. Un cycle complet du processus d'étalonnage comprenait des rotations dans le sens horaire (Pout augmentée de 1 à 10 kPa) et dans le sens antihoraire (Pout diminuée de 10 à 1 kPa). 15 cycles complets ont été utilisés pour calibrer les relevés de pression de sortie par rapport à la position du bouton. Afin de quantifier la stabilité des pressions régulées, des données ont été recueillies sur une période de 1000 min pour trois pressions désignées (Pout = 1, 5 et 10 kPa), couvrant les points de consigne bas, moyen et haut de la gamme. Il est important de noter que pour éviter la nécessité d'un nouvel étalonnage pour différentes configurations expérimentales, nous utilisons une grande résistance fluidique (20 µm × 100 µm × 32 cm) après le régulateur de pression. La résistance fluidique offrait une résistance beaucoup plus grande que les autres éléments en aval et nous a donc permis de retirer les capteurs de débit après l'étape d'étalonnage initiale sans nécessiter de réétalonnage. Cette approche équivaut à utiliser une impédance d'entrée élevée pour maintenir une chute de tension dans un système électrique.

La conception détaillée et la fabrication de la plate-forme de barrière ont été décrites dans nos précédents travaux45,46. En bref, la plate-forme de culture cellulaire se composait des microcanaux supérieur et inférieur, séparés par une nanomembrane ultrafine (SiMPore Inc., Rochester, NY, USA). La nanomembrane a une épaisseur de 100 nm et une taille de pores de 60 nm. Le dispositif a un module central à puits ouvert connu sous le nom de m-µSiM qui peut être reconfiguré en un dispositif fluidique en ajoutant un module d'écoulement dans son puits et en le scellant magnétiquement à l'aide de deux boîtiers avec des aimants intégrés. Le module d'écoulement a été fabriqué à l'aide de la méthode de lithographie douce standard et les boîtiers ont été fabriqués à l'aide d'un découpeur laser (série H 20 × 12, Full Spectrum, CA, USA). Les dimensions du canal supérieur étaient h = 200 µm, w = 1,5 mm et l = 5 mm, et le canal inférieur était h = 150 µm, w = 2–6 mm et l = 15 mm. Le flux du réservoir de milieu a été connecté à l'entrée du canal supérieur à l'aide d'un tube et d'embouts de distribution de calibre 21 21 NT (Jensen Global, États-Unis).

Avant utilisation, le circuit d'écoulement a été stérilisé par exposition à la lumière UV46. Étant donné que la pompe à air était utilisée dans un environnement incubé et stérile, une filtration supplémentaire de l'air de sortie n'était pas nécessaire. Avant l'ensemencement cellulaire, la nanomembrane a été recouverte de 5 µg cm-2 de fibronectine (Corning Inc., Corning, NY, USA) pendant une heure à température ambiante, puis rincée avec du milieu cellulaire frais. Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) ont été cultivées dans du milieu basal EBM-2 (Lonza Bioscience, Walkersville, MD, États-Unis) complété par du milieu de croissance de cellules endothéliales EGM-2 -2 BulletKit (Lonza Bioscience, Walkersville, MD, États-Unis) et maintenues dans un flacon de culture tissulaire. Avant utilisation, les cellules ont été dissociées à l'aide de TrypLE (Thermo Fisher Scientific, USA) pendant 3 min et centrifugées à 150 G pendant 5 min. Après remise en suspension, les cellules ont été ensemencées sur la surface de la membrane à travers le microcanal supérieur et incubées pendant 1 h pour favoriser la fixation des cellules.

Le µPR a été réglé sur une pression de sortie de 8 kPa (∆P = 8 kPa), ce qui correspondait à un débit de média de 1 µL min−1 (contrainte de cisaillement de 0,02 dynes cm−2 à la monocouche cellulaire) dans le canal supérieur pendant 24 h. La coloration LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a été utilisée pour évaluer la viabilité cellulaire sur la base du protocole du fournisseur. Les cellules marquées ont été imagées à l'aide d'un microscope à fluorescence Olympus IX-81 avec le logiciel CellSens (Olympus, Tokyo, Japon) avec des paramètres de capture d'image constants sur les ensembles expérimentaux.

Un microcanal PDMS en forme de Y composé de deux canaux d'entrée de 1 cm de long et d'un canal de sortie de 1 cm de long a été connecté à deux µPR (P1 et P2) et à deux micropompes alimentées par batterie. Chaque µPR était connecté à un capteur de pression pour mesurer la pression. P1 a été maintenu à 1,0 kPa tandis que P2 a varié. Nous avons accordé 30 s pour chaque étage P2 pour fournir une séquence de pressions : 1,0 kPa, 1,3 kPa, 1,0 kPa, 1,5 kPa, 1,0 kPa, 1,8 kPa et 1,0 kPa, pour un total de 3 min et 30 s. L'interface liquide-liquide entre les flux colorés a été enregistrée avec un stéréomicroscope SMZ-168 et sa caméra (Motic Co., ltd., Xiamen, Chine). Les données sont rapportées sous forme de valeur moyenne ± écart type.

Les régulateurs de pression sont couramment utilisés dans les circuits pneumatiques pour réduire l'air haute pression à un point de consigne de pression inférieur et contrôlable pour les applications en aval. Comme avec la plupart des régulateurs de pression manuels, notre µPR imprimé en 3D utilise un mécanisme d'équilibre des forces et est conçu pour maintenir un point de consigne défini par l'utilisateur adapté aux systèmes microfluidiques standard (~ 1–10 kPa). Comme le montre la figure 2, le µPR se compose d'une chambre à air haute pression, d'une chambre à air basse pression et d'un composant de contrôle de la pression. La chambre à air haute pression comprend les ressorts en porte-à-faux de fermeture (inférieurs), la soupape champignon et la bielle. Cette chambre reçoit une pression constante d'une pompe à air miniature. La chambre basse pression avec le diaphragme de détection de pression délivre la pression de sortie régulée. Le composant de contrôle de la pression se compose de ressorts en porte-à-faux supérieurs imprimés en 3D et du bouton de commande (un boulon et un écrou d'appariement), qui est utilisé pour contrôler la pression de sortie comme décrit ci-dessous. Le fonctionnement de µPR peut être décrit en quatre phases, comme illustré à la Fig. 3.

Schéma en coupe des composants essentiels du µPR imprimé en 3D. La chambre haute pression (rouge) reçoit une alimentation en air haute pression constante d'une source externe. La chambre basse pression (bleue) délivre de l'air à une valeur basse pression constante. La pression de sortie est contrôlée en ajustant le composant de contrôle de la pression, composé de ressorts en porte-à-faux et d'un bouton de commande.

Représentation des quatre phases du processus de régulation de la pression. Pendant la phase 1, le passage d'air est complètement fermé, tandis que nous fournissons de l'air à partir d'une source à haute pression constante. Dans la phase 2, l'utilisateur tourne le bouton de commande pour déplacer les porte-à-faux supérieurs. Lorsque la force de rappel du porte-à-faux supérieur (FT) augmente, le passage d'air entre les chambres reste fermé. En phase 3, lorsque FT dépasse une valeur seuil, le passage d'air s'ouvre. Enfin, dans la phase 4, la pression dans la chambre à air basse pression atteint le niveau souhaité fixé par la position du bouton de commande et le passage se fermera. Une fois la pression réglée par l'utilisateur, l'appareil alterne entre la phase 3 et la phase 4 pour maintenir la pression de sortie souhaitée.

De l'air à haute pression constant est fourni à la chambre à haute pression à l'aide d'une pompe à air miniature. Deux forces de fermeture sont présentes à ce stade. La force de pression d'entrée (Fin) est une force ascendante générée par la pression d'entrée agissant sur le clapet. La force du ressort en porte-à-faux de fermeture (FC) est une force constante vers le haut générée par le déplacement des ressorts en porte-à-faux inférieurs non réglables et est définie lors du montage. Ces forces ascendantes pressent le champignon contre le siège et ferment le passage d'air entre les chambres. Dans cette phase, la longueur du boulon sous l'écrou est L et la pointe du boulon repose contre le diaphragme de détection de pression sans exercer de force vers le bas.

Lorsque nous tournons le bouton de commande dans le sens des aiguilles d'une montre, la longueur du boulon sous l'écrou est augmentée à (L + ΔXT) et les ressorts supérieurs en porte-à-faux sont déplacés vers le haut de leur état détendu de (ΔXT). Ce déplacement vers le haut des ressorts en porte-à-faux génère une force de rappel vers le bas (FT = kTΔXT) sur le diaphragme de détection. Pendant cette phase, le passage de l'air est toujours obturé par les forces ascendantes (Fin et FC) car FT < Fin + FC.

Lorsque le bouton de commande est tourné davantage pour augmenter ΔXT, FT surmonte les forces vers le haut (Fin + FC) et la pointe du boulon déplace le diaphragme de détection de pression et la bielle vers le bas. Le mouvement de la bielle déloge la soupape champignon et ouvre le passage d'air, permettant à l'air à haute pression d'entrer dans la chambre à basse pression. La pression (Pout) dans la chambre basse pression exerce une force vers le haut (Fout) sur la surface inférieure du diaphragme de détection de pression (aire Ad), Pout = Fout Ad-1.

Pout augmente jusqu'à ce que la somme de Fout et d'autres forces ascendantes Fin, FC soit égale à FT, comme indiqué dans l'équation. (1). Ces forces ascendantes poussent la soupape champignon vers le siège et bloquent le flux d'air entre les chambres (Fig. 3). Cela permet de régler Pout en changeant la force du ressort du porte-à-faux supérieur (FT = kT ΔXT) en ajustant la position de rotation du bouton de commande. Étant donné que Pout est utilisé pour pressuriser un réservoir ou un canal de fluide en aval, Pout diminue et le µPR réintègre la phase 3 pour permettre à l'air à haute pression de compenser la perte de pression. Une fois que ΔXT est réglé par le bouton de commande, le µPR alterne entre les phases 3 et 4 pour maintenir un point de consigne stable, Pout.

Ici, la force du ressort en porte-à-faux supérieur FT = kTΔXT ; kT est la constante de rappel du ressort supérieur en porte-à-faux et ΔXT est le déplacement du ressort. La force de pression de sortie Fout = PoutAd ; Pout est la pression de sortie et Ad est la surface du diaphragme de détection. Fin est la force de pression d'entrée sur la zone exposée du clapet, et FC est une force de fermeture constante des ressorts en porte-à-faux inférieurs.

L'équation (1) se simplifie parce que les ressorts en porte-à-faux de fermeture dans la chambre haute pression ne sont pas réglables, et donc FC est une constante. L'ailette est constante tant que nous fournissons une pression d'entrée constante à la chambre haute pression. Parce que Fin et FC sont des constantes, nous pouvons contrôler Fout (donc Pout) en manipulant le FT appliqué au diaphragme. FT évolue linéairement avec le déplacement (ΔXT) des ressorts supérieurs en porte-à-faux, nous pouvons donc régler Pout en ajustant la position angulaire du bouton de commande. La vidéo supplémentaire S2 montre une animation du processus de régulation de la pression.

L'un des principaux objectifs de notre plate-forme de pompage est de fournir un contrôle de pression réglable tout en conservant une configuration portable. Par conséquent, nous avons choisi une pompe à air miniature alimentée par batterie au lieu d'une conduite d'air comprimé ou d'un cylindre sous pression comme source externe de haute pression. Étant donné que notre µPR fonctionne sur l'hypothèse d'une pression d'entrée constante (voir équation (1)), nous avons d'abord confirmé que la pression de la pompe à air miniature était stable dans le temps. Fonctionnant à 3 V, la pompe a maintenu une pression stable (41 ± 0,02 kPa) pendant 5 jours. Ensuite, nous avons cherché à caractériser la relation entre la position angulaire du bouton de commande et la pression de sortie résultante. Comme le montre la Fig. 4a, nous avons tourné le bouton de commande par incréments de 15˚ (correspondant à l'augmentation ou à la diminution de ΔXT sur la Fig. 3) et mesuré la pression de sortie. Les données ont révélé deux pentes distinctes. Dans la première région de la 1ère à la 9ème position (1,0–2,2 kPa), la pente était de 0,15 kPa par incrément de 15° tandis que dans la deuxième région de la 10ème à la 20ème position (2,6–10 kPa), la pente était de 0,70 kPa par incrément de 15°. Ces différentes pentes peuvent être une conséquence de la compressibilité du joint torique d'étanchéité sur la soupape champignon. C'est-à-dire que le joint torique peut être partiellement en contact avec le siège de soupape et limiter le débit d'air entre les chambres (positions 1 à 9). Avec une rotation accrue (positions 10 à 20), le joint torique se détache complètement du siège de soupape et l'air peut circuler entre les chambres avec moins de résistance, créant ainsi une relation de pente plus raide.

(a) Pression de sortie par rapport aux positions du bouton de commande (incréments de 15°). Les pressions ont augmenté par incréments de 0,15 kPa entre les 1ère et 9e positions (bleu) et par incréments de 0,70 kPa entre les 10e et 20e positions (rouge). (b) Test de stabilité de la pression de sortie avec des pressions réglées sur 1, 5 et 10 kPa, en tournant le bouton de commande sur les 1ère, 14ème et 20ème positions, respectivement, en suivant les résultats calibrés en (a). La pression a été mesurée sur 5 jours pour vérifier la stabilité de la pression de sortie régulée par l'appareil. Les trois pressions de sortie étaient de 1,1 ± 0,01 kPa, 5,2 ± 0,11 kPa et 10,2 ± 0,20 kPa tout au long du test de stabilité de 5 jours.

Pour assurer un débit contrôlé pour les applications de culture, il est important de fournir une chute de pression stable (∆P = Pout - Patm) à travers le réseau de microcanaux. Ici, la pression de sortie (Pout) régulée par le µPR permet d'établir \(\Delta P\). En utilisant les données d'étalonnage de la Fig. 4a, nous avons caractérisé la stabilité de Pout sur 5 jours à trois points de consigne différents, 1, 5 et 10 kPa. Comme le montre la figure 4b, les pressions de sortie étaient de 1,1 ± 0,01 kPa (erreur de 1,1 %), 5,2 ± 0,11 kPa (erreur de 2,2 %) et 10,2 ± 0,20 kPa (erreur de 1,9 %) et ont démontré la capacité du µPR à fournir des pressions réglables et stables sur toute la plage de sortie.

Ensuite, nous avons exploré comment le µPR pourrait être utilisé pour fournir une chute de pression stable à travers un canal microfluidique et produire des débits pratiques pour les applications de culture cellulaire. Le µPR a été conçu pour prendre en charge de faibles débits qui peuvent être difficiles à atteindre avec des régulateurs de pression commerciaux (par exemple, 10 à 100 nL min−1). Les débits ont été mesurés sur la Fig. 5 pour différentes pressions de sortie afin de quantifier la capacité du µPR à contrôler le débit de liquide. Nous avons introduit des pertes de charge, ∆P, de 1 à 8 kPa, en utilisant le µPR et mesuré des débits allant de 8,50 à 98,7 nL min−1. Nous avons observé une excellente corrélation (R2 = 0,999) entre les simulations COMSOL et les mesures expérimentales de débit (∆P de 1 à 8 kPa). La pente décrivant la relation est de 12 nL min−1 kPa−1.

L'encart montre la configuration du test, y compris le régulateur de pression qui crée un ∆P à travers le microcanal. ∆P est déterminé par la pression de sortie de µPR et la pression atmosphérique à l'extrémité du microcanal. ∆P (1 à 8 kPa) couvre des débits de 8,50 à 98,7 nL min−1, avec la relation décrite par la pente 12 nL min−1 kPa−1. La ligne droite est la réponse simulée des débits par rapport aux pressions manométriques de sortie. R2 = 0,999 est la corrélation entre les données expérimentales et les résultats de la simulation COMSOL.

Dans les systèmes microfluidiques, la perfusion de médias est nécessaire car le volume de médias à l'échelle du microlitre dans le canal est rapidement appauvri en nutriments par les cellules métaboliquement actives et doit être reconstitué pour maintenir la viabilité cellulaire. Pour démontrer la compatibilité de notre µPR pour contrôler le flux de fluide et maintenir les cellules, nous avons utilisé le µPR pour établir une monocouche endothéliale dans un modèle de barrière tissulaire que nous avons précédemment développé46. Comme le montre la figure 6a, la plate-forme de culture est constituée de deux microcanaux séparés par une nanomembrane. Le canal inférieur était rempli de milieu cellulaire tandis que le canal supérieur était alimenté par des flux pilotés par le µPR. Le µPR a induit une chute de pression stable de 8 kPa à travers le microcanal de culture supérieur, ce qui a entraîné un débit constant de 1 µL min-1 pour l'introduction du milieu cellulaire du réservoir dans la région de culture.

(a) Illustration schématique de la plate-forme de culture cellulaire. Une mini pompe à air fournit de l'air à haute pression à µPR, qui produit une chute de pression stable (ΔP) à travers le microcanal supérieur de la plate-forme. Cela se traduit par le flux de milieu cellulaire du réservoir dans le microcanal. La plateforme est constituée de deux microcanaux séparés par une nanomembrane ultrafine. Les composants de la plate-forme peuvent être démontés après l'expérience grâce à son mécanisme de verrouillage magnétique réversible. Nous avons défini la sortie de 8 kPa du µPR pour piloter le flux de milieu de culture (Q = 1 µL min-1). ( b ) Vue en coupe transversale de la monocouche endothéliale et comparaison des cellules cultivées dans (i) une culture dynamique (avec le flux) et (ii) une culture statique (sans flux). Les cellules ont été colorées avec une coloration LIVE/DEAD et des images de fluorescence ont été capturées en vert (cellules viables) et en rouge (cellules mortes). Cela démontre que le µPR peut entraîner un flux continu vital pour la culture cellulaire à long terme et la formation d'une monocouche cellulaire confluente. Barres d'échelle = 100 µm.

Comme prévu, les cellules cultivées dans l'appareil avec un flux de milieu piloté par le µPR ont été maintenues en vie et ont formé une monocouche confluente après 24 h, tandis que la majorité des cellules du contrôle statique sont mortes en raison d'un manque d'approvisionnement en milieu cellulaire (Fig. 6b). La coloration vivante/morte a montré un taux de survie de 98 % dans le dispositif fourni par µPR, tandis que le contrôle statique (pas de flux de média) avait un taux de survie de 38 %. Ces résultats ont confirmé la capacité du µPR à fournir des débits stables et à maintenir une culture cellulaire à long terme dans des dispositifs microfluidiques.

Étant donné que la pression de sortie peut être facilement modifiée en fonction de la position calibrée du bouton de commande, nous démontrons la réactivité de µPR à la commutation de pression en temps réel. Comme le montre la Fig. 7, nous montrons des changements de pression dynamiques qui couvrent toute la plage de pression : (a) 1 kPa–5 kPa–1 kPa, (b) 5 kPa–10 kPa–5 kPa et (c) 1 kPa–10 kPa–1 kPa. Dans cette expérience, nous avons de nouveau utilisé les résultats d'étalonnage présentés sur la figure 4a pour les points de consigne des positions du bouton de commande pour les pressions utilisées dans cette expérience. La figure 7 montre que notre µPR peut monter et descendre pour atteindre les points de consigne souhaités en une minute, même parmi les plus grands modèles de pression dynamique de l'expérience.

Les réponses dynamiques des modèles de pression, y compris, (a) 1 à 5 à 1 kPa, (b) 5 à 10 à 5 kPa et (c) 1 à 10 à 1 kPa sont obtenues via des tours de bouton de commande avec les données d'étalonnage de la Fig. 4a. Chaque modèle comporte trois étapes, chacune avec 200 s sous l'observation en temps réel de la réponse de pression dynamique.

Pour mettre en évidence l'intégration de plusieurs µPR dans un seul système, nous avons utilisé deux µPR pour contrôler séparément les débits de deux liquides dans un canal microfluidique en forme de Y et visualisé la position d'équilibre dynamique de l'interface de flux laminaire à double flux tout en ajustant un µPR à un nouveau point de consigne. Nous avons introduit de l'eau déionisée teintée en rouge dans l'orifice d'entrée supérieur du canal en Y avec une pression réglée sur 1,0 kPa µPR, P1. De l'eau désionisée teintée en bleu a été introduite dans l'orifice d'entrée inférieur avec une pression régulée par un deuxième µPR, P2 ; ces valeurs de pression ont été modifiées au cours de l'expérience d'une plage de 1,0 kPa à 1,8 kPa.

Comme prévu, lorsque P1 = P2, l'interface liquide-liquide entre les flux rouge et bleu était située au milieu du canal (ligne pointillée blanche), confirmant la capacité de fournir des débits stables en utilisant plusieurs µPR. Lorsque nous avons changé P2 de 1,0 à 1,8 kPa en tournant le bouton de commande, le débit dans le canal inférieur a augmenté et l'interface a été déplacée vers le haut (voir Fig. 8 et la vidéo supplémentaire S3, montrée à une vitesse 8x). Nous avons accordé une période d'observation de 30 s pour chaque nouveau point de consigne P2 avec la séquence de pressions suivante : 1,0 kPa, 1,3 kPa, 1,0 kPa, 1,5 kPa, 1,0 kPa, 1,8 kPa et 1,0 kPa, pour un total de 3 min et 30 s. L'interface liquide-liquide s'est déplacée en réponse au réglage de la pression P2, s'est rapidement installée dans la nouvelle position et a maintenu sa stabilité pendant chacune des périodes de surveillance de la pression de 30 s. La réponse dynamique de l'ajustement du débit µPR a démontré un ajustement de la pression en temps réel et des positions d'équilibre dynamique stables. Nous avons mis en évidence les capacités de contrôle de la pression du système et les possibilités de profil de débit pour des fonctionnalités en temps réel plus avancées qui nécessitent des contrôles de pression.

Observation en temps réel du flux de liquide co-laminaire pressurisé avec deux µPR. µPR #1 fournit une pression (P1) à un orifice d'entrée du canal d'observation du flux laminaire, tandis que µPR #2 fournit une pression (P2) à l'autre. P1 a été réglé sur 1 kPa, tandis que P2 a été ajusté sur (a) 1,0 kPa, (b) 1,3 kPa, (c) 1,5 kPa et (d) 1,8 kPa à l'aide du bouton de commande. Barre d'échelle = 1 mm.

L'objectif de notre plate-forme est de fournir une méthode de contrôle de flux microfluidique portable et simplifiée tout en fournissant des flux stables adaptés aux applications de culture cellulaire. Bien qu'il existe des solutions commerciales pour le contrôle de la pression pneumatique, ces régulateurs de pression ont des encombrements plus importants (> 30 mm), une plage de pression de sortie plus élevée (~ 35 kPa) avec une résolution plus faible (> 3,5 kPa). Ces approches ne peuvent pas non plus être personnalisées, sont coûteuses (> 100 USD pour une avec les fonctionnalités susmentionnées) et nécessitent une ligne d'air comprimé de laboratoire dédiée. Ces techniques sont résumées dans le tableau S2. En introduisant le µPR avec une mini pompe à air pour créer une plate-forme de contrôle de débit microfluidique, nous pouvons fournir une gamme de débits réglables et stables dans un système portable. Notre plate-forme fournit un schéma de contrôle de la pression rentable avec une gamme d'opportunités de personnalisation en raison de la disponibilité croissante des imprimantes 3D de loisirs et commerciales. Pour référence, le coût total de la configuration de la mini pompe à air et du µPR, comme indiqué dans ce travail, est inférieur à 7 USD, dont le µPR est inférieur à 1,20 USD, comme indiqué dans le tableau supplémentaire S1.

Dans notre conception (voir Figs. 2 et 3), le mécanisme de régulation de la pression est similaire à celui des régulateurs de pression conventionnels. Cependant, en incorporant des techniques d'impression 3D, nous avons pu intégrer deux ensembles de ressorts en porte-à-faux comme alternative aux gros ressorts commerciaux pour simplifier l'assemblage et aider à miniaturiser l'appareil. En incorporant des ressorts en porte-à-faux dans la conception de la soupape à champignon, nous avons créé une force de fermeture vers le haut (FC), comme illustré à la Fig. 3, pour empêcher une éventuelle fuite d'air haute pression vers la chambre basse pression à travers le passage d'air. Cette conception "normalement fermée" permet aux utilisateurs de couper la pression de sortie et de déconnecter momentanément les compartiments de culture cellulaire pour inspection ou modification. Étant donné que la régulation de Pout dépend des actions de fermeture de la soupape à champignon, nous avons choisi des joints toriques en élastomère imperméables aux gaz (shore 60A) au niveau du champignon pour une meilleure étanchéité. Cela convient à nos applications cibles, qui sont souvent exploitées avec un régime à basse pression et à faible débit. Pour cibler la plage de 1 à 10 kPa, nous avons choisi le boulon de taille M2 (pas de 0,4 mm, diamètre de 2 mm) comme bouton de commande avec un cadran à 24 positions. Une telle combinaison offre une résolution de pression suffisante (< 1 kPa par tour de 15°) tout en conservant un contrôle convivial. En ajustant certains paramètres mécaniques clés, tels que kT et Ad, nous pouvons atteindre différentes plages de pression de sortie ciblées. L'équation (2) montre que kT peut être modifié en modifiant les propriétés mécaniques du porte-à-faux en passant à un matériau différent ou en modifiant les paramètres de durcissement de l'imprimante 3D. kT peut également être modifié par la géométrie des porte-à-faux. Par exemple, nous pouvons augmenter la sensibilité à la pression lorsque nous diminuons kT, ce qui peut être obtenu en augmentant la longueur des ressorts en porte-à-faux ou en diminuant leur largeur ou leur épaisseur, comme indiqué dans l'équation. (2).

où E est le module de Young du matériau imprimé en 3D, et b, h, l sont respectivement la largeur, l'épaisseur et la longueur de chaque porte-à-faux.

Bien que kT soit plus sensible aux changements d'épaisseur (h) du porte-à-faux qu'à la largeur (b) (voir équation (2)), la précision z (c'est-à-dire le contrôle de l'épaisseur de couche) de l'imprimante 3D est souvent inférieure aux axes x-y, ce qui entraîne une plus grande variabilité de l'épaisseur51. Par exemple, un changement d'épaisseur de 0,1 mm (de 0,5 à 0,6 mm) des ressorts en porte-à-faux peut entraîner une augmentation de 70 % de la constante du ressort. Nous prévoyons que le µPR imprimé en 3D peut être modifié pour s'adapter à différentes plages de pression en fonction des descriptions mathématiques. Par exemple, l'augmentation de la surface du diaphragme de détection Ad peut améliorer la résolution du point de consigne de pression de sortie, mais entraîne une empreinte plus grande de l'appareil et une limite supérieure plus petite (contrainte par la force maximale du ressort en porte-à-faux) de la pression de sortie, puisque la force de sortie évolue linéairement avec la surface du diaphragme mais est limitée par la force du ressort en porte-à-faux supérieur.

Nous avons fabriqué notre appareil en empilant des composants imprimés en 3D avec un joint torique en tant que composant d'étanchéité clé pour séparer les chambres à haute et basse pression d'air. Des imprimantes 3D multi-matériaux peuvent être utilisées pour imprimer ce dispositif en une seule étape de fabrication avec des pièces rigides et flexibles pour une étanchéité robuste, mais ces imprimantes peuvent ne pas être accessibles dans tous les laboratoires. Pour les imprimantes à matériau unique, les techniques d'impression-pause-impression pourraient permettre le placement de matériaux souples pour le scellement pendant la fabrication, mais ajouteraient de la complexité et de l'incertitude à la fabrication52. Étant donné que les structures imprimées en 3D sont toujours associées à des erreurs dimensionnelles pour ces petites fonctionnalités d'appareil, chaque appareil doit être calibré pour déterminer la relation entre la position du bouton et la pression de sortie avec les équations mathématiques servant de directives de conception générales. La relation entre les positions des boutons de commande et les pressions de sortie, une fois calibrée, peut être utilisée pour produire la pression de sortie souhaitée dans d'autres applications. Le µPR n'entre pas en contact avec le fluide et peut être réutilisé selon les besoins. La configuration compacte et facile de la plate-forme de contrôle de débit microfluidique basée sur µPR permet un contrôle manuel de ΔP en fonction de l'étalonnage. La plate-forme de contrôle de débit dépendant de la perte de charge pour atteindre les débits requis, nous avons utilisé un système évolutif (pression en sortie de canal = Patm) pour limiter les effets de contre-pression. Au cours de l'expérience de culture cellulaire, nous avons pu fournir un débit constant de médias à la plate-forme de culture pour maintenir un environnement viable pour les HUVEC par rapport à la situation sans flux. Pour les réseaux microfluidiques plus complexes ou les systèmes à extrémité fermée, les utilisateurs peuvent ajouter des régulateurs de contre-pression pour augmenter le seuil de pression en aval à l'extrémité du réseau microfluidique afin d'éviter les refoulements potentiels, cependant, cela nécessiterait une plage plus élevée de pressions motrices pour fournir les mêmes débits26,53.

Avec la capacité de contrôle dynamique démontrée avec les flux co-laminaires, nous présentons plus de possibilités de contrôler dynamiquement la pression de sortie pour introduire différents débits de médias pour les changements de configuration de culture à l'aide de notre µPR (par exemple, ajustement de la contrainte de cisaillement à des fins d'alignement cellulaire) sans modifier la géométrie du canal. Contrairement aux pousse-seringues et aux solutions pneumatiques commerciales, le faible encombrement et les exigences minimales en équipement périphérique du système basé sur µPR permettent de le déplacer facilement dans et hors d'un incubateur de culture cellulaire. Bien que ce travail se concentre sur la création d'une plate-forme de culture cellulaire facile à utiliser, réglable et simple pour des débits constants uniques, des fonctionnalités de contrôle de débit automatisé, y compris des débits de rampe pulsés ou contrôlés, pourraient être introduites à l'aide d'un moteur pas à pas et d'un train d'engrenages pour programmer des ajustements aux positions du bouton.

En résumé, nous introduisons un µPR imprimé en 3D miniaturisé, facile à fabriquer, à faible coût et avons mis en évidence des capacités de contrôle de pression stables pertinentes pour de nombreuses applications microfluidiques. Nous avons également démontré que la plate-forme µPR et de pompage pouvait être utilisée pour maintenir les cellules dans un environnement de culture microfluidique compartimenté à base de membrane. Nous prévoyons que nos techniques de fabrication simples et nos fichiers de conception en libre accès permettront à d'autres laboratoires de personnaliser les µPR pour prendre en charge une large gamme d'applications microfluidiques où les pompes à seringue ou les méthodes pneumatiques traditionnelles sont difficiles ou peu pratiques à intégrer.

Toutes les données sont disponibles sur demande raisonnable. Les fichiers de conception CAO du régulateur de pression sont disponibles sur https://abhyankarlab.org.

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Ce travail a été financé en partie par le National Institute of Health sous les numéros de prix 1R43GM137651 et 1R61HL154249. Les auteurs remercient Xian Boles pour son aide à l'illustration et Nathan Tangeman du RIT pour son aide à la photographie.

Département de génie électrique, Rochester Institute of Technology, Rochester, NY, 14623, États-Unis

Meng-Chun Hsu & David A. Emprunteur

Département de génie biomédical, Rochester Institute of Technology, Rochester, NY, 14623, États-Unis

Meng-Chun Hsu, Mehran Mansouri, Nuzhet NN Ahmed, Stephen M. Larson, Indranil M. Joshi, Adeel Ahmed et Vinay V. Abhyankar

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MC.H., DAB et VVA ont conceptualisé le travail, MC.H. conçu et construit le système, MC.H., MM, AA, NNNA, IMJ et SML ont réalisé des expériences, MC.H. et MM ont analysé les résultats. MC.H. et VVA a écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Vinay V. Abhyankar.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Hsu, MC., Mansouri, M., Ahamed, NNN et al. Un régulateur de pression miniaturisé imprimé en 3D (µPR) pour les applications de culture cellulaire microfluidique. Sci Rep 12, 10769 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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Reçu : 15 avril 2022

Accepté : 17 juin 2022

Publié: 24 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-15087-9

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